细胞生物学的研究.ppt

第三章细胞生物学研究方法 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜：以电子束为光源。 扫描隧道显微镜 —、光学显微镜技术 （一）普通光学显微镜 ①照明系统 1. 构成： ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。 几种介质的折射率 3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 ? R=0.61λ/N ．A ． – 其中λ为入射光线波长；N ．A ．为镜口率＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 ? 思考：如何提高显微镜的分辨能力？ 特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。 特异蛋白质等生物大分子定性 定位研究，标本需特异荧光染料，光源为短波光 用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 laser confocal scanning microscope, LCSM 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。 （五）相差显微镜 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 用途：观察未经染色的玻片标本 （六）偏光显微镜 polarizing microscope 用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。 光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（与起偏器方向垂直的偏振片）。 载物台是可以旋转。 （七）倒置显微镜 inverse microscope 物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。 （九）当代显微镜的发展趋势 采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。 自动化与电子化。 二、电子显微镜 不同光线的波长 TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM 2、制样技术 1）超薄切片 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。 2）负染技术 用重金属盐（如磷钨酸）对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 3）冰冻蚀刻 freeze-etching 亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。 （二）扫描电子显微镜 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。 Scanning electron microscope（ SEM） 扫描电子显微镜原理 STM image, Benzene molecules accumulate at step edges on Cu 三、显微操作技术micromanipulation technique 在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 细胞核移植技术已有几十年的历史，Gordon等人（1962）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等上个世纪70年代在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作，并取得了丰硕成果。 电子显微镜与光学显微镜基本区别 第二节 细胞组分的分析方法 一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。 转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。 转速25kr/min，离心力89kg者称为超速离心机。 目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。 ? 特点： – 介质密度均一 – 速度由低向高，逐级离心 ? 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 ? 沉降顺序：核—