检测磷酸化蛋白和总蛋白的机理和实验技巧总结,研究人员转发.docVIP

. . 检测磷酸化蛋白和总蛋白的机理和实验技巧总结，研究人员转发 检测磷酸化蛋白的抗体是针对该蛋白的特异性磷酸化位点的，而检测总蛋白的抗体一般针对的是该蛋白别的位点，故而磷酸化抗体检测不到总蛋白，而总蛋白抗体能检测包括磷酸化和未磷酸化蛋白在内的目的蛋白。磷酸化蛋白的Western Blotting检测是信号通路研究中的经典方法。 本文根据丁香通llllcjchina站友的【做磷酸化蛋白的western blot之我见】一文详细总结了操作过程中的注意的事项，供刚入门的同仁们参考： 1. 一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。附：lysis buffer配方 Buffer Company Cat.No. Stock Working 100ml MW g/100ml ml Tris 1.080382.2500(Merck) 121.14 1M 12.114 5 NaCl 31434(Riedel-deHaen) 58.44 5M 29.22 3 NP-40 I-3021(Sigma) 10% 10 10 Sodium deoxycholate D6750(Sigma) 414.6 10% 10 2.5 EGTA.4Na E8145(Sigma) 468.3 0.25M 11.7075 0.4 Protease inhibitors Aprotenin A6279(Sigma) 10mg/ml 0.1 Leupeptin 10mg/ml 0.1 PMSF 100mM 1 Phosphatase inhibitors b-glycerophosphate 1M 1 Na3VO4 S6508(Sigma) 183.9 200mM 3.68 0.5 NaF 1.06449(Merck) 41.99 0.5M 2.0995 0.2 H2O 78.2 说明：(1) Na3VO4要活化：Activation ofSodium Ortho Vanadatea. Make Sodium orthovanadate to 200mM in ddH2O。 用ddH2O配制200mM浓度的原矾酸钠（3.68克原矾酸钠加入100ml ddH2O中）b. Adjust pH to 10.0 with 1M NaOH or 1M HCl (the starting pHvaries depending on the lot of the chemical)。At pH 10.0the solution is yellow。以1M NaOH 或1M HCl调整pH值至10.0，此时溶液呈黄色。 c. Boil the solution until it turnscolorless (about 10 mins)。煮沸直至溶液变为无色。 d. Allow solution to cool to roomtemperature。 冷却至室温。e.Readjust pH to 10.0 and repeat steps c duntil the soluition remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. Store inaliquots at -20°C。 重调pH值至10.0，重复c、d两步，直到变为无色且pH值稳定至10.0，分装保存在-20°C。 NOTE: Activation depolymerizes the vanadate, convertingit to a more potent inhibitor of protein tyrosine phosphatases. See: Gordon J.Methods Enzymol. 1991, 201:477-82. (2) 我的配方配的是100ml 细胞裂解液，但如您各个成分的体积加起来，会发现total=102.1ml，那是因为这些成分加在一起后总体积会缩小的。 (3) lysis buffer的使用方法： a. 细胞用typsine消化下来后，PBS洗2次(1500rpm，离心5min)，然后加适量lysis buffer(1×107个细胞约用200ul，但建议根据自己的实验条件调整ul数，使后来测定的蛋白浓度在5-10ug/ul左右，但不需要太精确)。冰浴30min(中间最好vortex一下)，然后12000rpm，4度，离心15min，取上清，然后进行后继实验如测定蛋白浓度等。 b. 保存在-80℃冰箱可以保证蛋白磷酸化的程度不受影响。提取蛋白时，组织要在液氮中研