荧光定量技术及miRNA定量.docx

荧光定量PCR技术及其在microRNA定量分析方面应用 摘要 荧光定量PCR技术是近几年在PCR技术基础上发展起来的一种核酸定性定量技术。荧光定量 PCR 具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点, 扩大了PCR 的应用范围，成为分子生物学和医学研究中的重要工具。microRNA是存在于真核生物中的一种大小为20-25nt的非编码RNA。自2001年被发现以来，一直备受关注。论文综述了荧光定量PCR 技术的原理、荧光定量PCR 实时定量检测系统及其在microRNA表达分析方面的应用。 关键词：荧光定量PCR 荧光染料 探针标记 microRNA定量 1前言 荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。该技术是由美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，目前已经得到广泛应用。它不仅实现了PCR技术从定性到定量的飞跃，更重要的是与常规PCR相比，它具有操作简便、快速高效、高通量、特异性强、灵敏度更高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭式反应等优点成为分子生物学和医学研究中的重要工具[1]。 microRNA( miRNA)是一类广泛存在于真核生物中, 不编码蛋白质的短序列RNA,长度为20-24nt。成熟miRNA的5’端为磷酸基团, 3’端为羟基, 它通过与靶mRNA3’端非编码区特异性结合,引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译, 从而调低基因表达。miRNAs在控制真核生物生长发育、新陈代谢和生理反应等方面起着重要作用。除此之外, 多数miRNA还具有高度保守性、时序性和组织特异性[2-6]。目前大量miRNA在真核生物中被发现, 但绝大多数miRNA的生物学功能研究尚显滞后, 而miRNA生物学功能研究的重要一环是探究miRNA在特定时期、特定组织及特定环境的表达特性, 进而实现miRNA对目标基因的调控。利用荧光定量PCR技术，了解miRNA在不同组织部位的时空表达是研究其功能的重要环节。 2荧光定量PCR原理 荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其基本原理是在PCR体系中加入荧光基团，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线或其他方法对未知模板进行相对或绝对定量分析的方法[7]。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，这是由于随着PCR循环数的增加，DNA聚合酶的失活，dNTP和引物的枯竭以及反应副产物的干扰等原因造成的。此阶段PCR扩增产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增产物很难对原始模板进行准确定量[8]。 为了便于对所检测样本进行比较，在实时荧光定量PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般这个域值（threshold）是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。另外阈值与扩增出线的交点为Ct值，C代表Cycle（循环） ，t代表threshold(阈值) 。Ct值是指每个反应管内的荧光信号达到阈值时所经历的循环数（threshold cycle）[9]。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小[10,11]。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值如下图所示。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 3荧光定量PCR技术中标记方法的分类 荧光定量检测可分为扩增序列非特异和扩增序列特异两类检测。根据所使用的标记物不同又可分为荧光染料法和荧光探针法两种。荧光染料法包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ，饱和荧光染料有Eva Green、LC Green等；荧光探针法包括水解探针法