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液相色谱分离蛋白的新原理 2015年，耿信笃等人发现蛋白分离的新原理为：在梯度洗脱条件下的蛋白 保留的总时间是由在“停滞区（SR）”内的不动时间和在“迁移区（MR）”内蛋 白的移动时间的双变量参数控制的， 简单地称其为“滞-动”分离机理。前者 蛋白的保留是由蛋白与色谱固定相间的多种分子相互作用力的强弱控制，分离好 坏不遵守塔板理论，故与色谱柱长无关，但对蛋白分离做出了主要贡献；而后者 是由蛋白移动的快慢是由蛋白在流动相与固定相间的分配系数大小决定，分离优 劣遵守塔板理论，其分离度取决与色谱柱长。 该 “滞-动”分离机理可用图1表示为： 图 1 不同时间进样的保留时间 T(R, i) 对进样时间 Ting 作图 图 a:核糖核酸酶 A; 图 b:苯乙醇 黄色区为“停滞区”， 垂直箭头为临界点。 （文献：X.D. Geng et al,, Analyst , 2015, 140, 6692 – 6704 ） 在该二区之间分界点称之为“临界点”，在该临界值即为在该停滞区蛋白与 固定相间作用力大小的表征，其量纲可以是该蛋白开始移动（移动了3σ）的瞬 间，称之为临界保留时间，也可以是对应于该移动瞬间的流动相中置换剂的瞬时 浓度， 称之为临界浓度。 该总保留时间 t 的表达式: R t = T + T + T R 0 (R,S) (R,M) 总保留时间，t 包含死时间,T ; 停滞时间, T ; 迁移时间, T . R 0 (R,S) (R,M) 图1所示的黄色区域，即SR区内，无论何时，进多大体积的样品，都不会 改变目标蛋白的保留时间，如此该 SR 区就可变成了一个可实施许多辅助色谱分 离的“操作空间”，如在二维液相色谱（2D-LC）中，对从第一维流出液的在线缓 1 冲溶液交换、在线浓集、在线除盐等， 在几分钟之内就能完成。而这些辅助操 作通常是要化费很长的时间和大量的人力和物力，以离线的形式进行的。如此， 传统的色谱柱的色谱分离的单一功能就会变成也能实施非色谱的其他分离的功 能。换句话讲， 传统的色谱是众多分离方法中的一种，想在反过来，如图 2 所 示的，在色谱柱上也可实施其他分离方法。 Seperation Science vs. Liquid Chromatography 图 2 液相色谱和分离科学的相互依存关系图 其实， 在梯度洗脱条件下，所有的多肽和大部分的普通小分子溶质也有同蛋白 一样的“滞-动”双变量分离机理【Min Li et al, Chin. Sci. Chem. 2016, accept article】. 每一种溶质均有其各自的临界值”，他就相当于通常色谱中的“保留 因子，K 一样。在液相色谱 的 100 余年的历史中，人们一直在用分配系数来描 述色谱分离机理，现看来，只了解了液相色谱的一半【XD Geng et al, ATLAS, 2015, Oct. 11】。 色谱饼（变性蛋白分离与纯化装置） 依据传统的单一变量分配系数决定溶质在液-固两相间的分离优劣，长的色 谱柱较短好，而带来的问题是色谱柱压很高，于是需要在高压（5,000PSI）和超 高压（5，000~20,000 PSI）的色谱仪上才能进行分离。另外，需要很长的时间 才能实现一次分离。然而 30 年前从实验结果就得出可用 3~5 Cm 长的色谱柱分 离蛋白，其分离度不会受影响，这实际上是对传统色谱的塔板理论的挑战。然而