第三章发酵工艺学.ppt

确定出发菌 ↓ 菌种的纯化选优 ↓出发菌株性能测定 同步培养 ↓ 制备单细胞（单孢子）悬液 ↓ 诱变剂选择与诱变剂量的预试验 ↓ 诱变处理 ↓ 平板分离 ↓计形态变异菌落数、计算突变率 挑选突变菌落纯培养 ↓ 突变株的初步筛选 ↓ 重复筛选 ↓摇瓶发酵试验 选出突变株进行生产试验 (一)出发菌株的选择 1．选纯种：①要选择发酵产量稳定，波动范围小菌株②如菌种不纯，可采用自然分离或用缓和诱变剂处理 2．选产量高的，产孢子早而多，考虑产色素的多少，生长速度快慢等利用发酵产物合成因素。 3.选择对诱变剂敏感菌株 (二)处理菌悬液的制备 单细胞或单孢子菌悬液的制备 在诱变育种中要求待处理的菌悬液呈分散的单细胞或单孢子状态，这样一方面可以均匀地接触诱变剂，另一方面又可避免长出不纯的菌落。 菌悬液一般可用生理盐水或缓冲溶液配制，如果是用化学诱变剂处理，因处理时?pH值会变化，必须要用缓冲溶液。除此之外，还应注意分散度，方法是先用玻璃珠振荡分散，再用脱脂棉或滤纸过滤，经处理，分散度可达90％以上，供诱变处理较为合适。 (三)诱变处理 诱变剂的选择 1、遗传不稳定菌株，采用温和的或已见效果的诱变剂；遗传稳定，采用强烈、不常用、诱变谱广的诱变剂。注意变换诱变剂 2、注意选择适合的，考虑诱变剂本身的特点。如：紫外线作用于DNA分子的嘧啶碱基；亚硝酸作用于DNA分子的嘌呤碱基。 3、选择最适剂量。低剂量诱变剂可能更有利于高产菌株的稳定。 影响诱变效果因素 1、出发菌株的遗传特性 2、诱变剂 3、菌种的生理状态 4、被处理菌种的预培养条件 5、诱变处理外界条件 (四)中间培养 由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。 方法： 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。 (五)分离和筛选 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。 例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。 五、筛选的方法 随机筛选：摇瓶筛选法、琼脂块筛选法 形态 理性化筛选 从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。 1、初级代谢产物高产菌株的筛选 ①降低终产物浓度：筛选终产物营养缺陷型、筛选细胞膜透性改变的突变株 ②筛选抗反馈突变菌株：筛选结构类似物抗性突变株、利用回复突变筛选抗反馈突变菌株 2.次级代谢产物高产菌株的筛选 1.利用营养缺陷型筛选 2.筛选负变株的回复突变株 3.筛选去磷酸盐调节突变株 4.筛选去碳源分解代谢调节突变株 5.筛选氨基酸结构类似物抗性突变株 6.筛选二价金属离子抗性突变株 7.筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 8.筛选自身所产生的抗生素抗性突变株 营养缺陷型突变株的筛选 营养缺陷型菌株是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质(如氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶碱基等)的能力，必须在其基本培养基中加入相应缺陷的营养物质才能正常生长繁殖的变异菌株。其变异前的菌株称为野生菌株。 利用营养缺陷型筛选次级代谢物高产菌株的筛选过程：先进行摇瓶发酵试验，选出对抗生素发酵产量有明显影响的初级代谢产物，据此诱变出相应的营养缺陷型，然后再诱发回复突变或将野生型菌株诱变成另一营养缺陷型，再与之杂交。 第三节 杂交育种 指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。 特点：1、定向育种 2、对诱变剂敏感 3、技术要求高，应用受限制 一、常规的杂交育种 1、遗传标记（营养缺陷型） 2、异核体：两个直接亲本菌株经过细胞间接合而形成一条菌丝里含有两个遗传特性不同的细胞核。 3、杂合二倍体 4、染色体交换和单倍化 二、原生质体融合（p