第四章载体演示文稿.pptVIP

第四章 载体 载体：将外源DNA携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载（Vector）。 载体实际上就是具有运载能力的DNA。 第一节 载体的功能及其特征 一、载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件 二、载体应具备的条件 1.具有对受体细胞的可转移性2.具有与特定受体细胞相适应的复制位 点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记 三、载体的种类 依据功能，载体可分为克隆载体和表达载体两类。 克隆载体用于在宿主细胞中克隆和扩增外源片段；表达载体则用于在宿主细胞中获得外源基因的表达产物。 作为基因工程克隆载体由多种不同的部分组成，包括复制区、启动子、抗性基因等。按照基本组成元件的来源不同（载体复制子来源不同），又可以将载体分为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、黏粒载体和人工染色体载体等多种类型。 第二节 质粒载体 一、质粒：质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA），并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵抗外界环境因素不利影响的能力。分子量在1-200kb之间。质粒可在细菌间转移。 质粒常见于原核细菌和真菌中 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多少，质粒可分为两类： 严谨型质粒和松弛型质粒。一般要求用松弛型的质粒作为载体。 严谨型质粒控制拷贝数， 1 – 几个 松弛型质粒控制的复制 10 - 60 拷贝，可达几百 二、常用的质粒载体 天然质粒尽管在理论上和遗传学研究中有重要作用，但作为基因工程的载体实有困难，因此必须对其进行必要的改造，天然质粒载体存在着不同程度的局限性，因此不能直接用作克隆载体，必须进行修饰和改造。现在通用的基因克隆载体，大多数都是以天然质粒为基础所改造来的。 1．pBR322 重要的大肠杆菌质粒载体 2．pUC系列 图3.2 pGEM-T Vector 载体图及克隆位点 Fig 3.2 Cloning site and pGEM?-T Vector 图3.3 T克隆位点的核酸序列示意图 Fig 3.3 Nucleotide sequences of T cloning site 3. 质粒载体pGEM?-T Vector 图 重组质粒DNA 分子转化的操作程序 图 重组噬菌体DNA 分子转染的操作程序 人工染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千 kb 的DNA片段，此时质粒和噬菌粒载体的装载 量也远远不能满足需要。 人工染色体（artificial chromosome vector） 利用染色体的复制元件来驱动外源 DNA片段复制的载体称人工染色体 目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人工染色体（ bacterial artificial chromosome ， BAC ）：本质仍是质粒载体，但由于其采用了大质粒（F质粒）的复制元件，可像YAC载体一样装载大片段DNA，因此，沿用了人工染色体这一名词。 表达载体：穿梭载体、整合载体 基因文库的基本概念 基因库与基因文库 基因库（gene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库（gene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： 基因组文库（含有全部基因） cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） 基因芯片