第18章基因操作.ppt

第一节 基因的克隆与表达 一、基本概念 二、基因的获取和克隆 三、克隆基因的表达 一、基本概念 基因工程（genetic engineering） 指把一个生物体中的基因通过无性繁殖转入另一个生物体内的过程。通过基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所以也称其为DNA克隆 基因重组（gene recombination） 二、基因的获取和克隆 （一）目的基因的获得 PCR反应系统组分 模板DNA（高温变性） Taq DNA聚合酶（耐高温） dNTP（底物） 引物（DNA，人工合成） Mg2＋ PCR的基本原理和操作程序 2.用RT-PCR（逆转录-PCR）获得基因 以mRNA为模板，先进行逆转录得到cDNA（complementary DNA，cDNA），再进行的PCR反应 RT-PCR的基本原理和操作程序 3.从基因组文库或cDNA文库中获取基因 基因组文库（genomic DNA library） 含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体 cDNA文库（cDNA library） 含有某一组织细胞中的全部mRNA信息 文库构建 提取染色体DNA ↓ DNA片段 ↓ 插入适当的克隆载体 ↓ 转入受体菌扩增 ↓ 基因组文库 细胞总mRNA ↓反转录酶 cDNA ↓ 插入合适载体 ↓ 转入受体菌 ↓ cDNA文库 4．人工合成基因 用PCR技术人工合成的DNA片段 （二） 目的基因克隆 （三）目的基因的改造 二、克隆基因的表达 原核细胞：大肠杆菌 真核细胞：酵母、昆虫、哺乳动物细胞 2.原核细胞表达载体 蛋白表达方式 原核细胞表达系统的优缺点 3.真核表达载体 真核细胞表达系统的优缺点 一、DNA测序 2.DNA自动化测序 二、DNA一级结构的简单分析 探针种类 cDNA探针 基因组DNA探针 寡核苷酸探针和RNA探针 探针标记方法 化学法 酶促法 2. 基因组PCR反应 用途 定性分析特定基因在基因组中存在与否 定量或半定量分析 优点 灵敏度高 缺点 容易出现假阳性 定量或半定量分析基因时需设内参照 3.荧光原位杂交 优点 非放射性荧光标记的DNA探针 探针特异性高,灵敏度好 荧光显微镜观察 成本低 一次可检测多个基因 原理： 与Southern印迹相同 用途： 鉴定RNA片段 步骤 与Southern类似 关键技术 RNA样品的制备和电泳分离 2.RT-PCR 用途：??? 定量检测基因的表达情况 步骤： 提取总RNA→逆转录成cDNA→以cDNA为 模板行PCR扩增→电泳→检测基因的表达量 关键点： 提取的总RNA的质量 3.实时PCR（real time RT-PCR） 原理： 根据荧光染料形成特异性荧光信号的强度， 计算出模板DNA或mRNA的含量 用途：???定量分析mRNA或DNA 优点： 可进行自动化定量分析、降低假阳性 4.RNA酶保护试验（RNase protection assay，RPA） 5.芯片技术 一、定位克隆策略 表现型(包括疾病) ↓ 对应的基因组区域 ↓ 建立结构基因表达的转录图 ↓ 选出异常表达的结构基因 ↓ 确定这些基因与疾病的关系 定位候选克隆 大量定位克隆的基因序列已知（HGP的完成） ↓ 从数据库中检索该标志附近与该区域之中所有已 知的基因（连锁分析或染色体分析） ↓ 用已知基因进行致病改变的筛选. 基因定位的基本方法 体细胞杂交法 将来源不同(人与鼠)的两种细胞融合成1个新细胞。在融合过程中人类染色体逐渐丢失，最后只剩条或数条，即可定位基因 原位杂交和荧光原位杂交（FISH） 连锁分析 应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位 定位克隆的基本程序 二、功能克隆策略 已知蛋白