中性粒细胞碱性磷酸酶染色偶氮偶联法作业指导书.doc

中性粒细胞碱性磷酸酶染色偶氮偶联法作业指导书 1. 实验原理 在PH9.2-9.8的缓冲溶液中，细胞中的碱性磷酸酶能将底物磷酸苯酚钠水解，生成 α-苯酚和磷酸钠，再以稳定的重氮盐与酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中。 2. 标本采集 2.1 病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史，凝血因子严重缺陷引起的出血 性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠的妇女作骨穿时要慎重。 2.2 标本种类： 新鲜抽取的骨髓穿刺液。 2.3 标本采集要求： 2.3.1 高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。 2.3.2 临床上首选穿刺部位为髂后上棘，翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部位。小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。 3. 标本储存：滴加95％ 乙醇盖满血膜10分钟，水洗待干，室温避光保存。 4. 标本运输：室温运输。 5. 标本拒收的标准：溶血，稀释标本不能作测定。 6. 试剂： 6.1 试剂名称：中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂。 6.2 试剂生产厂家：上海太阳生物技术公司 6.3 试剂组成： 试剂1. 固定剂：甲醛10ml加甲醇90ml混合，2℃~8℃避光保存，有效期6个月。 试剂2. 贮存液：200mgα-磷酸苯酚钠(AS-BI)溶于1mlN-N二甲基甲酰胺+200ml Tris-Hcl缓冲液，2℃~8℃避光保存。 试剂3. Tris-Hcl缓冲液，Tris 4.85g溶于200ml蒸馏水，加浓Hcl1滴~2滴，PH固定为9.1。 试剂4. 作用液：取贮存液2ml于温水中30℃预热5分钟加坚固蓝BB盐2mg，混合。 试剂5. 中性红溶液：2℃~8℃避光保存。 7. 操作步骤： 7.1 新鲜干燥涂片滴加固定剂作用2~5秒，水洗，待干。 7.2 滴加作用液室温染色15~20分钟，水洗，待干。 7.3 中性红复染3分钟，水洗，干后镜检。 8. 结果判断：阳性反应，棕黑色颗粒定位于胞桨中。在油镜下计数100个中性粒细胞，求出碱性磷酸酶阳性细胞百分比，并求出积分。 9. 临床意义：NAP的积分，参考值为35-70分。 9.1 生理性变化：新生儿NAP活性增加，以后下降，成人较儿童活性减低，老年期更低。应激状态如紧张，恐怖，激烈运动等NAP活性可增加。月经前期增高，行经后降低，经后期恢复。 9.2 病理性变化： 9.2.1 NAP积分增加：见于细菌性感染，再障，某些骨髓增殖性疾病(如慢粒，骨髓纤维结，真性红细胞增多症，原发性血小板增多症)，慢粒加速期和急变期，急淋白血病，慢淋白血病，恶性淋巴瘤，骨髓转移癌，肾上腺糖皮质激素及雄激素治疗后。 9.2.2 NAP积分下降：慢性粒细胞白血病慢性期，阵发性睡眠性血红蛋白尿，MDS，恶性组织细胞病。 10. 操作性能：快捷简便，特异性强，灵敏度高。 11. 方法局限性： 11.1 标本应新鲜，且未受其它化学物品污染。 11.2 重氮盐以坚固蓝BB盐为最佳，其次为B盐。 11.3 坚固蓝应适量，过多易致染色失败，过少则反应较弱。 11.4 使用液配好后应立即使用(5分钟内)。 11.5 应作阳性对照。 12. 参考文献： 谭齐贤主编，临床血液学和血液检验，人民卫生出版社，2002，北京：47-49