基因甲基化给研究生讲课课件2.ppt

DNA甲基化的相关蛋白 DNA 甲基化的机制 1) DNM T1, 持续性DNA 甲基转移酶 使仅有一条链甲基化的DNA 双链完全甲基化； 参与DNA 复制双链中的新合成链的甲基化； DNM T1 可能直接与HDAC (组蛋白去乙酰基转移酶) 联合作用阻断转录。 2)DNM T3a、DNM T3b从头甲基转移酶 它们可甲基化CpG, 使其半甲基化, 继而全甲基化； 可能参与细胞生长分化调控, 其中DNM T3b在肿瘤基因甲基化中起重要作用。 DNA甲基化的机制 DNA甲基化反应分为2种类型： 一、从头甲基化：2条链均未甲基化的DNA被 甲基化。 二、保留甲基化：双链DNA的其中1条链已存在甲基化，另1条未甲基化的链被甲基化。 DNA 去甲基化 1) 被动途径: 由于核因子N F 粘附甲基化的DNA , 使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化, 从而阻断DNM T1 的作用。 2) 主动途径: 是由去甲基酶的作用, 将甲基基团移去的过程。 哺乳动物细胞中已知有活性的 DNMT 有 3 种 ，它们是 DNMT1 、DNMT3a 、DNMT3b 。 DNMT1 的主要功能是作为 DNA 复制复合物(DNA synthesome) 中的组分 ，催化子链 DNA 半甲基化位点甲基化 ，维持复制过程中甲基化位点的遗传稳定性； DNMT3a 和 DNMT3b 主要催化从头甲基化 ，以非甲基化的 DNA 为模板 ，催化新的甲基化位点形成 ，在胚胎发育中起重要作用。 甲基化的检测方法 高效液相色谱法 组织DNA提取(酚-氯仿法) DNA的水解 取相当于50微克DNA的溶液用40%的氢氟酸溶解,调整DNA浓度为1g/L。100°C水浴3 h使DNA水解完全。氮气吹干备用。上样前将处理好的DNA样品加入200 微升新鲜配制的0.05 moL/L磷酸二氢钾溶液溶解。 胞嘧啶3.36 min; 5-甲基胞嘧啶4.33 min;腺嘌呤7.06min;鸟嘌呤8.43 min;胸腺嘧啶13.98 min 一、甲基化分型 绝大多数的DNA 甲基化分型均基于聚合酶链反应( PCR )的方法, 使用亚硫酸氢钠处理过的DNA 作为模板。PCR 引物设计上通常存在2 种策略: 甲基化非依赖性PCR( methy lation??independent PCR, M IP)引物: 甲基化特异性PCR ( m ethylat ion specific PCR, MSP)引物。 （1） 甲基化特异性PCR (m ethylat ion2specif ic PCR,M S PCR )　 该法是检测基因组DNA 甲基化水平的一种常用方法, 原理是DNA 经亚硫酸氢钠处理后, 非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR 反应时, 有两套不同的引物对: 其一引物序列来自经处理后的甲基化DNA 链, 若用该对引物能扩增出片段, 说明该检测位点发生了甲基化; 另一引物来自经处理后的非甲基化DNA 链, 若用该对引物能扩增出片段, 说明该检测位点没有甲基化。 两对引物都具有很高的特异性, 与未经处理的DNA 序列无互补配对。 M S PCR 是一种快速检测方法, 只需极少量的DNA 用于分析。 不足之处在于: ①引物的选择和设计非常关键, 否则易导致假阳性; ②如果亚硫酸氢钠对DNA 处理不完全, 也易导致假阳性; ③M SP 法是以引物中所有CpG 位点胞嘧啶均甲基化为前提设计的, 而事实上甲基化的CpG 岛中却并非每个CpG 位点都完全甲基化, 所以,M SP 法常常存在目标片段难扩增, 或者特异性差等问题, 不能反映整个CpG 岛甲基化状态的缺陷。 中国科学院化学研究所与清华大学的研究人员合作, 发展了基于水溶性阳离子型共轭聚合物的新DNA 甲基化分析方法. 通过荧光共振能量转移技术(FRET)研究了质粒和人肿瘤细胞p16 基因启动子区特异CpG 位点的甲基化状态(原理见图1). 该技术具有较高的灵敏度和特异性,引物无需荧光标记, 检测在均相溶液中进行, 无需分离、纯化手段, 而且与高通量分析兼容, 在癌症临床诊断上具有潜在的应用价值。 共轭聚合物具有强的光捕获能力, 具有倍增光学响应性, 可用来放大荧光传感信号, 为生物传感器的发展提供了新的传感模式. * * 表观遗传学 从根本上讲，表观遗传是环境因素和细胞内的遗传物质之间发生交互作用的结果。 与中心法则不同