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His标签融合蛋白纯化步骤
His标签融合蛋白纯化步骤
(Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化法)
1. 缓冲液配制
Lysis Buffer 1 (under native condition)
0.5mM Tris.HCl
0.5M NaCl
5%(w/v) glycerol
10mM Imidazol
100mg(1mg/ml)lysozyme (Purification of 6xHis-tagged proteins
from E.coli)
1% Nonidet P40 (NP40 = Igepal CA-630 )
0.25% Tween 20 (or Triton 100 )
0.02% NaN3 (Optional)
2 tablets of protease inhibitor cocktail (EDTA free , Recommended)
200 µg(2µg/ml) RNase A (Optional)
1mg (10µg/ml) DNase1 (Optional)
50 mM NaF (Optional)
1mM Na VO (Optional)
3 4
+ ddH O to 100ml, Adjust pH to 8.0 using NaOH
2
此 lysis buffer 适用于从 E.coli 、哺乳动物细胞和昆虫细胞中纯化带His 标签的蛋白质。仅在用
于裂解 E.coli 细菌时,加入溶菌酶。
Na3VO4 是磷酸酶抑制剂,保护磷酸化的蛋白不被磷酸酶还原。NaF 是酯酶抑制剂,保护脂蛋白
不被酯酶降解。
注意:当使用镍琼脂糖凝胶纯化带His 标签的蛋白时,缓冲液中不能加EDTA ,因EDTA 能使
镍从螯合物上脱离,从而使分离介质失去效果。
Lysis Buffer 2(under denature condition)
50 mM Tris-Cl
8 M Urea (or 6 M Gu-HCl)
10mM Imidazole
0.05% Tween 20
Adjust pH to 8.0 using NaOH
Dialysis/Tev cleavage Buffer
50 mM Tris-Cl,pH8.0
100 mM NaCl (depends on solubility of protein)
2.5% glycerol
0.5mM EDTA
0.5mM DTT or TCEP
1 / 3
缓冲液A :
50mM Tris.HCl
0.5M NaCl
5% glycerol
0.05% Tween 20
用高浓度HCl调节pH值至8.0。
缓冲液B (洗脱缓冲液):
50mM Tris-Cl
0.5M NaCl 5% glycerol
0.05% Tween 20
500mM咪唑
用高浓度HCl调节pH值至8.0。
缓冲液C(咪唑梯度洗脱液):用缓冲液A和缓冲液B按不同比例配制,配制比例如下(100ml
总体积):
咪唑浓度 缓冲液A(ml) 缓冲液B(ml)
0mM 100 0
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