酶联免疫检测技术讲义.ppt

实施策略 两种方式拟合 四参数Logistic曲线拟合 Logit-log 直线回归 总结与讨论 问题： 直线回归有几种常用方式？说明各自特点。 曲线拟合有几种常用方式？说明各自特点。 如何评价剂量反应曲线拟合方式？ 天津医科大学 李会强 酶联免疫检测技术 实验一 酶联免疫吸附试验 （验证性实验） 实验目的 验证酶联免疫吸附试验的基本原理 掌握双抗体夹心酶联免疫法的基本原理 掌握酶联免疫试剂盒的基本组成 熟悉酶联免疫操作方法 实验内容简介 酶联免疫吸附试验是最常用的酶联免疫分析技术，有四种基本类型：夹心法（双抗体夹心和双抗原夹心）、间接法、竞争法、捕获法。 本实验以双抗体夹心法测定乙型肝炎表面抗原（HBsAg）为例，验证酶联免疫吸附试验的基本原理。 实验原理 双抗体夹心法 筛选两种抗-HBsAg（针对不同抗原表位），一种连接于固相载体制备酶标反应板；另一种标记过氧化物酶制备酶标抗体。测定时，待测抗原分别与固相抗体和酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体双抗体夹心复合物。 实验材料 ELISA试剂盒 预包被抗体酶标反应板 系列标准品抗原 酶标抗体（抗HBsAg-HRPO） 质控血清 显色底物 终止液 浓缩洗液 实验方法 制备酶标板 包被 封闭 实验准备 标本编号 所有试剂平衡至室温 稀释洗液 实验方法 操作步骤 加标准品或待测样本，37℃温浴30 min； 洗涤3~5次，加酶标记抗体； 37℃温浴30 min； 洗涤3-5次，加显色液A和显色液B； 室温15 min，再加入终止液; 读取A450nm 绘制标准曲线 采用Logistic曲线拟合 剂量反应曲线 结果判断 准确使用微量加样器 所有试剂需平衡至室温 加入试剂或标本后需轻轻振荡 洗涤过程要标准化 注意事项 实验讨论 问题: HBsAg定量分析的临床意义？ 酶联免疫吸附试验的注意事项？ 如何检测抗-HBsAg？ 天津医科大学 李会强 实验二 酶免疫组织化学染色技术 （验证性实验） 实验目的 验证酶免疫组织化学技术的原理 掌握PAP-酶免组化法的检测原理 熟悉PAP-酶免组化技术操作要领 实验内容简介 酶免疫组织化学技术集抗原抗体结合的特异性、酶免疫分析的敏感性和组织化学技术的直观性特点为一体，常用于细胞鉴定、抗原定位、病理组织观察等方面。 本实验以辣根过氧化物-抗辣根过氧化物免疫组化技术检测成熟CD3+ T细胞为例，对这一技术的原理和操作流程进行验证。 实验原理 要点： 特异性抗体识别抗原 PAP复合物的放大效应 桥联抗体连接作用 实验材料 一抗（识别抗体）： 抗CD3抗体 PAP复合物： 过氧化物酶 抗-过氧化物酶 二抗（桥联抗体）： 兔抗鼠Ig 实验方法 分离外周血单个核细胞 采用密度梯度离心法分离 制片 免疫反应 加一抗，37℃ 60 min 洗涤玻片3次 同时加桥联抗体和PAP复合物， 37℃ 30 min 洗涤玻片3次 加底物显色 镜检 注意事项 制片时，细胞均匀，密度适中 免疫反应过程中， 洗涤充分 湿盒中反应，防止干片 镜检时，注意区分特异和非特异 结果分析 采用高倍镜观察计数。将待检载破片置普通光学显微镜下观察，阳性细胞呈棕黄色，计数200个细胞，计算CD3+细胞的百分比。 实验讨论 思考题： 酶免疫组织化学技术的影响因素有哪些？ 在酶免疫组织化学技术中，为何不直接将酶蛋白标记在抗体分子上？ 酶免疫组织化学技术有何优点？ 天津医科大学 李会强 实验三 酶联免疫试剂盒的研制 （设计性实验） 实验目的 熟悉酶联免疫试剂盒研制要点 抗原纯化与抗体制备 制备酶标记抗原（或抗体） 方法选择与设计 筛选抗体（抗体匹配） 优化反应条件 实验相关知识简介 理论知识 酶联免疫吸附试验 相关技术 蛋白纯化 酶标记化合物制备 酶标反应板制备 实验要求 题目： 假设需采用酶联免疫法测定某种肿瘤标志物，设计实验如何制备酶联免疫试剂盒？ 要求： 设计实验方案，绘制技术路线图 说明重要实验内容和实验方法 实施策略 重要环节： 纯化抗原和制备抗体 方法学选择与设计 抗原抗体选择 抗体匹配（双抗体夹心法） 确定工作浓度 优化反应条件 总结与讨论 问题： 研制酶联免疫试剂盒需做哪些准备工作？ 如何根据待测物质特性选择合适反应类型？ 双抗体夹心法如何进行抗体匹配实验