基因组DNA的提取及电泳鉴定.ppt

氯仿作用： a. 氯仿的变性作用不如酚好， 但与酚共同/交替使用可增强去蛋白效果； b. 氯仿有加速有机相和水相的分离、 去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性； 2、酚/氯仿 3、氯仿/异戊醇 ( 24 : 1) 氯仿的作用： 去除DNA水溶液中残留的微量酚。 异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。 在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNA发生沉淀。可离心收集 . 核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。 最常用沉淀剂为1价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋酸钠、NaCl、氯化锂、氯化钾等 常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等。 5、无水乙醇 ： 作用：提供单价阳离子。 4、醋酸钠：3M NaAc pH: 5.2 课间休息 同学自己练习： 加样器使用提示： （1）吸头的安装要紧密。 （2）打到第一挡，将吸头插入液面下适当深度（3）缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在液面下停留一下（约半秒钟）（4）将外壁液体用容器口引流回容器。吸头内的体积应大致正确。（5）贴目的容器内壁，将液体匀速打到目的容器内，加样器推到第二挡。观察吸头内液体是否完全打出。 十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。 蛋白酶K,再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得总DNA溶液。 10:00上课 1、加入550ul(等体积)TE饱和酚, 混匀1min. 10,000rpm, 2 min。 (注意抽取下层酚相; 酚可腐蚀加样器等, 加样器头用过即弃掉) (轻柔混匀，避免DNA链断裂; 但是太轻又起不到变性蛋白的作用) 2、将上层水相移至一新管中 (要尽量抽尽，又不可吸起酚相)。 加入500ul(等体积)酚/氯仿 (已经配好，体积比1:1), 同上条件混匀、离心。 3、 将上层水相移至一新管中。 加入500ul(等体积)氯仿-异戊醇，同上条件离心、取上清。 4、加入1/10体积（约30ul）醋酸钠于上清中充分混匀。 加入2-2.5倍体积无水乙醇（约1ml） （通常加满小离心管）， 混匀后交给老师，（统一置）-20 ℃ 1 h ( 或-70 ℃ 10 min)。 实验第二部分、 酚氯仿抽提DNA及乙醇沉淀 乙醇沉淀后午休。 注意事项： 1） 本实验将用到的TE饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇是有机试剂，比水的比重大，而DNA溶解在水里，我们总是取上清。 2） 在抽取完苯酚、氯仿等有机试剂，不能将加样器平放或倒置，以防液体导流损坏加样器，加完样后立即弃掉加样器头。 3）?基因组DNA由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此，为了得到完整的基因组DNA，尽量不要多次进行物理性操作。 7、加入13 ?l 双蒸水, 溶解沉淀，-20℃保存。 6、10,000 r/min 离心 5 min，弃上清。 8 ?l： 酶切、电泳 余 5 ?l ：PCR模板（下次课进行）。 蓝头 黄头 滤纸条 (吸干内壁液体) 观察DNA沉淀的颜色。 一定要充分 溶解沉淀 8、基因组DNA的酶切： 基因组DNA 8 ul 10x Buffer H 1 ul EcoR I(最后加入) 0.6 ul 置 37 ℃ 保温 45 min。 实验第三部分：基因组DNA的酶切 1:00~2:20 课间介绍（2）：1. 酶切相关知识 1、酶活性单位 Unit （U）： 1U: 是指在1小时内，适当温度下(37°C)，在50ul 反应体系中，将1ug of lambda DNA(底物DNA)完全消化所需的酶量。 2、酶切体系：