流式细胞凋亡分析报告.ppt

流式细胞分析细胞凋亡 常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 注意事项：②70％的乙醇固定效果最佳，甲醛或多聚甲醛均会影响亚二倍体的出现。 ③4℃或-20℃固定效果比37℃好。 ④固定过程中要充分混匀细胞，避免细胞团块形成。 流式细胞分析细胞凋亡 常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 PI单染色法的最大优点在于获得凋亡细胞百分数的同时，可以与细胞周期中其他时相的细胞进行比较。方法简便、标本制备容易，检测费用低，是目前最经典也是最常用的细胞凋亡检测方法。 流式细胞分析细胞凋亡 常用的细胞凋亡检测方法 1 PI单染色法 但是PI单染色法无法确认是来自哪一时相的凋亡。对于S期和G2/M期的细胞发生凋亡时，凋亡峰有时与G1峰或S峰重叠，导致G1峰或S峰增宽，或无典型的亚二倍体峰出现。 流式细胞分析细胞凋亡 常用的细胞凋亡检测方法 2 AnnexinⅤ/PI双染色法 凋亡发生时，胞质膜的变化发生最早。在凋亡早期阶段，细胞内Ca2+持续、快速升高，致使大量Ca2+激活谷氨酰胺转移酶，谷氨酰胺转移酶的活化使胞质膜的不对称性丧失，导致膜内侧PS从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的AnnexinⅤ探针所标记。 流式细胞分析细胞凋亡 常用的细胞凋亡检测方法 2 AnnexinⅤ/PI双染色法 AnnexinⅤ为35-36KDCa2+依赖性磷脂结合蛋白，对PS有极强的亲和性，并可被FITC、PE等荧光物质标记。因此，采用AnnexinⅤ这一敏感的探针可检测暴露于细胞膜表面的PS。 流式细胞分析细胞凋亡 常用的细胞凋亡检测方法 2 AnnexinⅤ/PI双染色法 但是，PS转移到胞膜外不是凋亡细胞所特有的，也可发生在细胞坏死中。二者的差别在于凋亡早期胞膜是完整的，而坏死在早期胞膜就被破坏了。 流式细胞分析细胞凋亡 常用的细胞凋亡检测方法 2 AnnexinⅤ/PI双染色法 PI对胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞拒染，而对晚期凋亡和坏死细胞可以染色。因此，AnnexinⅤ结合PI进行双染色可用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。 流式细胞分析细胞凋亡 常用的细胞凋亡检测方法 2 AnnexinⅤ/PI双染色法 制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/ml，加入AnnexinⅤ-FITC和PI，轻轻混匀，室温、避光孵育15min，1h内进行流式检测。 流式细胞分析细胞凋亡 常用的细胞凋亡检测方法 2 AnnexinⅤ/PI双染色法 激发光波长为488nm,用525nm的带通滤片检测FITC，用610nm的带通滤片检测PI。分别通过FITC和PI对数荧光直方图或散点图分析活细胞、凋亡细胞和坏死细胞百分率。 流式细胞分析细胞凋亡 常用的细胞凋亡检测方法 2 AnnexinⅤ/PI双染色法 对照设定：1单纯活细胞，不加AnnexinⅤ和PI；2活细胞只加AnnexinⅤ，不加PI；3活细胞只加PI，不加AnnexinⅤ；4已知凋亡的细胞系作为阳性对照；已知未凋亡的细胞系作为阴性对照。 流式细胞分析细胞凋亡 常用的细胞凋亡检测方法 2 AnnexinⅤ/PI双染色法 流式细胞分析细胞凋亡 常用的细胞凋亡检测方法 2 AnnexinⅤ/PI双染色法 凋亡时胞膜改变远远早于DNA改变，因此，AnnexinⅤ/PI双染是检测早期凋亡的敏感方法。由于必须用活细胞，因此检测时间受到严格限制，而且对晚期凋亡细胞和坏死细胞无法准确区分。 流式细胞分析细胞凋亡 常用的细胞凋亡检测方法 凋亡相关蛋白的检测 Caspase-3、Fas、P53、bcl-2等。 知识回顾Knowledge Review 流式细胞分析细胞凋亡 细胞对染料吸收能力的检测 由于EB、PI和7-AAD不能进入具有完整细胞膜的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在未固定时对这些染料是拒染的，而坏死细胞胞膜完整性已破坏，可被染色。因此，这些染料可被用来鉴别死细胞和活细胞。 流式细胞分析细胞凋亡 细胞对染料吸收能力的检测 赫斯特类染料（特别是HO33342)检测细胞凋亡的原理与上述染料不同。HO33342是双苯并咪唑家族成员之一，能特异与DNA螺旋中富含A-T重复序列结合。HO33342用氪激光激发紫外线荧光，激发光波长为352nm，发射光波长为400-500nm，产生蓝色荧光。 流式细胞分析细胞凋亡 细胞对染料吸收能力的检测 HO33342能被活细胞摄取，而其从细胞内排出是一个耗能的主动过程，依赖细胞膜上的P-糖蛋白泵。活细胞染色时，应考虑是否存在细胞抗药性问题，如有耐药性，则染色效果不佳。HO33342进入凋亡细胞比正常细胞多，将其与PI结合对凋亡细胞进行双染，可将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区