课件：HLC方法开发——流动相的选择.ppt

10．流动相的pH值 反相离子抑制技术： 采用反相色谱法分离弱酸或弱碱样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术。 对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的解离平衡常数Ka值越小，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在； 对弱碱，流动相的pH值越大，组分的Ka值越大，当pH值远远大于弱碱的pKa值时，弱碱主要以分子形式存在； 分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用10～50mmol/L磷酸盐缓冲液，0.05%TFA ； 分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用10mmol/L三乙胺溶液， 0.05~0.5%NH4OH。 10．流动相的pH值 当溶液pH值等于化合物的pKa时，化合物半解离。 在pKa±1.5的范围内，保留随pH值的变化而发生明显变化。 超过此pH值范围，化合物完全解离或不解离，保留随pH值的变化很小。 了解化合物的pKa值，可在pKa±2的范围外调节流动相的pH值，使化合物有较好的峰形，保持保留的恒定，使建立的方法具有耐用性。  10．流动相的pH值 11. 缓冲盐 HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。 在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。 清洗液配制: 90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。 当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，因此此时应该在进液口位于混合器下方放置含盐流动相进液口位于混合器上方放置不含盐流动相； 11. 缓冲盐 缓冲剂 pKa 缓冲范围 UV截止波长nm 磷酸盐 2.1 1.1-3.1 200(0.1%) 7.2 6.2-8.2 12.3 11.3-13.3 柠檬酸盐 3.1 2.1-6.4 230(10mM) 4.7 5.4 甲酸盐 3.8 2.8-4.8 210(10mM) 乙酸盐 4.8 3.8-5.8 210(10mM) 氨水 9.2 8.2-10.2 200(10mM) 三乙胺 11 10.0-12.0 200(10mM) 12. 离子对试剂 作用原理：离子对试剂与待分析的物质（多为在溶液状态时显以与离子对试剂相反的电荷）结合成离子对而呈中性，这样非极性就表现出来，从而在色谱柱上有保留行为。 试剂选择：分析酸性（作用基团）样品一般用阳离子对试剂（ 四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵），分析碱性样品用阴离子对试剂（己烷磺酸钠、辛烷磺酸钠……十二烷基磺酸钠） 离子对的分离机制------离子对模型 样品离子首先在流动相中与离子对试剂的反离子生成不荷电的疏水性离子对，然后溶解或吸附于非极性固定相上。离子对试剂的烷基C链越长，生成的离子对与固定相的亲和力越大，因此组分的保留值也越大。 使用离子对试剂浓度尽可能的低（一般0.005mol/L)， 以 保证对柱子填料的稳定性影响最小及清洗方便。  12. 离子对试剂 离子对试剂使用注意的因素有： 1、离子对的浓度，这个一般情况下在满足要求的前提下 越低越好。 2、 离子对溶液的pH，这个是进行分离的最关键的因素，而只能在缓冲液中测定pH, 不要混合有机相后测定。 3、如果使用离子对试剂，一定注意平衡时间，正常的话在60-90分钟才能达到彻底的平衡，还有在实验结束以后要冲洗超过2个小时，否则柱子可能会不可逆的损伤。 4、用离子对进行实验所用的柱子尽量和其他的非离子对的分开使用。  13. 各种检测器对流动相的特殊要求 13.1 UV： 截止波长:将溶剂装入1cm的比色皿，以空气为参比，逐渐降低入射波长，溶剂的吸光度A＝1时的波长。 中国药典对UV法溶剂的要求是： 以空气为空白，溶剂和吸收池的吸收度： 在220~240nm范围内不得超过0.40 在241~250nm范围内不得过0.20 在251~300nm范围内不得过0.10 在300nm以上不得过0.05 13. 各种检测器对流动相的特殊要求 13.2 ELSD ELSD对流动相的组成不敏感，可以用于梯度洗脱； ELSD要求流动相要蒸发掉，因此不能使用不易挥发的物质来调节流动相的pH值。 13. 各种检测器对流动相的特殊要求 13.3 MSD 由于盐对质谱的损伤很大，故在流动相的选择上，需避免使用不可挥发性盐，尽量少使用可挥发性盐。故一般离子对色谱和离子抑止色谱方法的流动相是不能