细胞传代冻存复苏步骤.docVIP

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. . 准备工作: 1、进入细胞室前,首先用75%酒精擦试工作台,接着紫外灭菌30-50min,过后,关闭紫外灯,通风10min。 2、从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基开紫外时即将当天实验所用物品拿出,室温放置一段时间 开紫外时即将当天实验所用物品拿出,室温放置一段时间 注意事项: 1、所有实验用的器械,仪器灭菌,消毒,烘干。 2、打开溶剂,培养瓶瓶盖时,瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。 3、用完溶剂,培养瓶时,瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。 开始工作: 1、实验前换衣帽,开风淋,吹风。 2、75%乙醇擦手,然后用75%乙醇擦一下台面,点燃酒精灯。 3、取待用的细胞,旋紧瓶盖。 4、弃去旧的培养液,把培养瓶放回原处。 5、取移液管一支,塞棉花端,及管身,均在酒精灯上烤一下,套好吸球。 6、用移液管加入适量的PBS缓冲液,缓慢荡洗一下细胞,然后将PBS缓冲液弃掉。 7、用移液管(微量枪)吸取适量胰酶约2ml(所用胰酶的量),弃掉枪头。 8、将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1min-2min,目的:提高酶活性,促进消化。 9、取待用细胞,取移液管一支,塞棉花端,及管身,均在酒精灯上烤一下,套好吸球。 10、用移液管加入适量的完全培养液冲洗(吹散细胞)细胞,将瓶底粘着的细胞吹散下来,再将细胞悬液移入的离心管中,封口,标签。 11、离心5min,1000转/min。 以下分别介绍: 一 换液 1、取待用的细胞,旋紧瓶盖。 2、弃去旧的培养液,把培养瓶放回原处。 3、取移液管一支,塞棉花端,及管身,均在酒精灯上烤一下,套好吸球。 4、用移液管加入适量的PBS缓冲液,缓慢荡洗一下细胞,然后将PBS缓冲液弃掉。 5、取移液管一支,塞棉花端,及管身,均在酒精灯上烤一下,套好吸球。 6、用移液管加入适量的细胞培养液于培养瓶中。 7、将细胞置于5%CO2、37度培养箱培养。 二 传代 1、细胞离心毕,拆封,瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下,弃去上清液,吸取已配制的培养基适量,加入离心管中,将细胞重悬、吹匀。 2、取4-6滴细胞悬液到新的培养瓶中,培养瓶中应先加好适量细胞培养液,吹散细胞,镜下观察,细胞密度适宜则置入5%CO2、37度细胞培养箱中。 三 冻存 1、细胞离心毕,拆封,瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下,弃去上清液。 2、按胎牛血清:DMSO=9:1的比例配制冻存液,装入青霉素瓶中。 3、用移液管将冻存液平均加入离心管中,混匀离心管中细胞冻存液。 4、用移液管将含细胞的冻存液移入冻存管中,封口,标签。 5、冻存,需缓慢冻存,先放置4度冰箱1小时,然后放置-20度冰箱2小时,再置于-80度冰箱过夜,最后置于液氮灌中保存。 四 种板 1、细胞离心毕,拆封,瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下,弃去上清液。 2、取培养瓶及小烧杯各一只,摆放好。 3、取移液管一支,塞棉花端,及管身,均在酒精灯上烤一下,套好吸球。 4、先移取2ml,5ml,20ml完全培养液,分别加入到离心管,培养瓶,小烧杯中。 5、混匀离心管中含完全培养液的细胞,再从离心管中取适量细胞悬液移入培养瓶,吹散细胞。镜下观察,细胞密度适宜则置入5%CO2、37度细胞培养箱中。(细胞传代目的) 6、取细胞计数板,盖玻片酒精擦拭,均在酒精灯上烤一下,用微量枪从小烧杯中取出细胞悬液(约10μl),弃掉枪头,滴入盖玻片下(不能有气泡,不然会影响细胞计数),镜下观察细胞数(每个象限5个细胞,总和20个细胞,5×104个),不断调整小烧杯中细胞悬液的细胞浓度,直至镜下观察细胞数目符合要求。 7、取1个96孔板,用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周,孔板盖在酒精灯上烤一下。 8、用微量枪从小烧杯中取出细胞悬液(约100μl),依次滴入96孔板中(枪头至孔下1/3处),同时用移液枪吸取完全培养液(约100μl)作为对照或调零,边缘孔用无菌PBS填充。 9、滴完后,仍用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周。 10、将96孔板置于5%CO2、37度细胞培养箱中进行培养。 五 MTT实验 1、接种细胞:用含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积100μl。 2、称取3mg MTT粉末,加6ml完全培养液,配制成浓度5%的MTT溶液,0.22μm的微孔滤膜除菌。 3、培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。 4、培养3-5天后,取出96孔板,用酒精棉绕96孔板边缘处擦拭一周,孔板盖在酒精灯上烤一下。 5、用(120μl)移液枪小心吸弃孔内培养上清液(包括调零孔内的培养上清液),弃去枪头。再用移液枪按每孔100μl加MTT溶液也包括调零孔,但边缘孔除外(枪头在孔上1/3处)。 6、呈色:继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养

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