细胞培养的基本技术研究.ppt

(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和?2×DMEM培养基(含有 2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注 入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固， 可作底层琼脂置CO2温箱中备用?。 (4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌 试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充 分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双 琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中 培养10～14天。? (5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算 形成率。 ? ?? 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。 试验中琼脂与细胞相混时?，琼脂温度不宜超过 40?℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35?个，? 一般6cm的平皿接种1000?个细胞。正常细胞在 悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形 成试验。 5.?细胞周期? 三、培养细胞的检测指标? mitoses，PLM）：? ?? 标 记 有 丝 分 裂 百 分 率 法 （ percentage? labeled? ?? 对测定细胞进行脉冲 标记、定时取材、利用放射自显 影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百 分数的办法来测定细胞周期?。放射标记物为?3?H或者 14?C标记的TdR。 T?G2? +1/2T?M? T?G2? 100? 50? 0? T?M? T?s? T?c? 常以T?C?- （T?G2?+T?M?+T?S?）的方式求出T?G1 Chapter?3? 细胞工程基本实验技术 ◆ 实验室设施与基本条件 ◆ 无菌技术 ◆ 显微技术 ◆ 细胞观察与分析 ◆ 细胞分离 ◆ 细胞保存与复苏 ◆?Light?microscopy? ◆?Electron?microscopy? ◆?Scanning?tunneling?microscope? ◆?Micromanipulation?technique? 3.3? 显微技术? 二、 培养细胞的观察方法 细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和 显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细 胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变 酸、变黄是否更换等。 由于细胞小而复杂，若不借助适当的手段，则 难以观察其形态、结构，更难发现细胞内各种组分 的分子组成及功能。目前，已有多种研究细胞的技 术，从光镜到电子显微镜，从一般细胞化学法到免 疫化学法等。 1.?肉眼观察? 变浅变黄。? ?? 肉眼观察培养液的颜色和?透明度的变化。 ?? 正常情况下，培养液 pH介于 7.2～ 7.4之间，呈桃红 色清亮透明。（ 指示剂：?酚红） ?? 培养时，细胞代谢会使培养液 pH值下降，引起颜色 ?? 发现培养液变黄，应及时换液传代 。一般生长稳定 的细胞 2～ 3天换液一次， 生长缓慢的细胞 3～ 4天换 液 一 次。 酚红在培养基中被用来作为为PH值的指示剂:中性时为 红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。 苯酚红?Phenol?red? 别名：酚红；苯酚磺酞；Phend-?-sulphonphthalein? 分子式：C19H1405S? 相对分子质量：354．38? 性状:?红色结晶性粉末。微溶于水，易溶于乙醇及碱溶液， 不溶于三氯甲烷及醚。溶于稀碱溶液呈红色。 用途：酸碱指示剂，pH值1.2（橙）～3.0(黄），6.5（棕 黄）～8.0(紫红） 问题：细胞培养过程中，培养基会逐渐变黄，为什么？ 培养基如果暴露在空气中会逐渐变紫?，为什么？ （page45） ?? 生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度 2.?显微镜观察? 大，折光性强，轮廓不清?。 ?? 相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构?。 ?? 若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强 ，细胞折 光性变弱，胞质中出现空泡 、脂滴和其他颗粒状物 质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失 去原有细胞的特点，产生圆缩脱落 ，有时细胞表面 及周围出现丝絮状物。发现这种情况应及时处理 。 ◆ 倒置显微镜 培养的CHO细胞 ◆ 相差显微镜 相差显微镜的结构 ?? 相差显微镜由相差聚光器和相差接物镜两个主要部分 组成。它与普通光镜相比多了两个部件，一个是在聚 光器上增加一个环形光阑， 使透过聚光器的光线形成 空心光锥、聚焦到标本上。 另一个是在物镜的后焦面 增加一个相板，相板有一个环形区 ，其大小恰好通过 环形光阑束的直射光，相板各区镀以不同物质，使得