细胞培养技术 教学课件 ppt 作者 兰容 周珍辉 主编 章静波 主审 实验部分7动物细胞的传代培养.pptVIP

实验七 动物细胞的传代培养 一、实验目的 掌握动物细胞培养传代的基本方法和操作过程。 二、实验原理 当原代培养细胞或细胞系细胞增殖达到一定密度后（一般形成致密单层），则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，以适当比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，此过程为传代培养。一般将传代培养的累积次数作为传代细胞的代数。 三、器材 超净工作台 二氧化碳培养箱 普通显微镜 倒置显微镜 酒精灯 吸管 四、试剂和材料 Hanks液 75％酒精 0.25％胰蛋白酶 DMEM培养液 (含小牛血清及青、链霉素) 五、操作 1、吸去或倾出旧的细胞培养液(对于小口的培养瓶可采用倾倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出)。 2、吸取适量的Hanks液加入培养瓶中,轻轻振荡后弃去，重复一次,以清除血清成分,利于胰酶消化。 3、加入适量0.25%胰蛋白酶（一般0.1～0.2mL/cm2，以消化液能覆盖整个瓶底为准）转动培养瓶，使其湿润整个细胞层，37℃下消化2-3分钟。翻转培养瓶,肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜出现针孔大小空隙时即可吸除消化液(细胞的解离程度也可以通过倒置显微镜直接观察判断，一般以细胞突起缩回，细胞之间间隙增大，细胞缩成圆形等为准)。如消化程度不够，可延长消化时间；如见大量细胞片状脱落，表明已消化过头，则不能吸除消化液而直接进行下一步操作。 4、加入适量培养液终止消化 5、吸取瓶中培养液反复吹打瓶皿底壁上的细胞层，至全部冲下，轻轻吹打，混匀，成细胞悬液，取样计数，调整细胞密度为5×104 /ml。15cm培养瓶培养时，吸取1ml细胞悬液加到新培养瓶中，加入4ml培养液，盖好，置37℃孵箱中培养。 6、观察：细胞传代后，应每日对细胞进行观察，注意是否污染及细胞贴壁和生长情况。 六、注意事项 1、吹打过程需有序进行，即从一边开始到另一边结束，注意边角处。 2、吹打时动作不宜过猛。 七、结果与讨论 1．利用倒置显微镜，绘制出传代细胞生长图。 2．讨论影响本次实验能否成功的主要因素 * * 培养瓶 烧杯 离心管 离心机 镊子（圆头） 血球记数板