菌种来源课程教学课件.ppt

单孢子悬液的制备： 混合接种的斜面培养后长出一层孢子，待孢子成熟后，制备单孢子悬液； 洗去可能携带的完全培养基成分； 浓度107—108/ml 重组体检出： （原养型重组体检出） 原养型重组体是两亲本各带遗传标记的染色体片断重组在一起，由于营养互补作用，对营养要求表现了两个原始亲本的表型，但从基因型而言，是新的基因型重建。 方法：将混合培养的孢子稀释液分离到基本培养基平板上，培养10-15d，出现较大的菌落，这些菌落除了回复突变和互养杂合系菌株之外几乎都属原养型重组体。 原养型重组体往往具有两亲本的优良性状。 杂合系分析： 取混合培养孢子悬浮液分离到基本培养基平板上，适温培养3-5d，形成大小不同的菌落，其中较大的是一些原养型菌落，较小的是一些杂合系菌落。 杂合系所产生的孢子，重新分离到产生它们的基本培养基上时，容易发生遗传分离，几乎都成了两亲本分离子，重组体较少，也几乎没有杂合系菌落生长。 1、营养缺陷型菌株的筛选 ◆ 育种标记 氨基酸、核苷酸生产菌株 等 ◆ 影印培养法 夹层培养法 逐个检出法 等 影印培养法检出营养缺陷型 夹层培养法检出营养缺陷型 点植法检出营养缺陷型 2、抗性突变株的筛选 ◆ 育种标记 抗生素 金属离子 温度 噬菌体 ◆ 提高某代谢产物的产量 如 抗氯霉素的解烃棒杆菌突变株比亲株产生的棒杆菌素高3倍。（氯霉素是棒杆菌素的结构类似物） 又如，蜡状芽孢杆菌的抗利福平无芽孢突变株的?-淀粉酶产量提高了7倍。 ◆ 筛选检出抗药性突变株可用梯度培养皿法 筛选抗噬菌体突变株 以高浓度噬菌体平板筛选抗性菌株 3、温度敏感突变型筛选 TS（Ts; ts）突变株 （temperature-sensitive mutant） ? 指仅在某个温度范围内显示与野生型不同表型的突变型。 高温敏感突变型：在某个温度以上显示出和野生型不同表型。 低温敏感突变型：在某个温度以下显示出与野生型不同表型。 ? 如果发生这类突变的基因控制的特性是生长繁殖不可缺少 的，那么就会形成条件致死突变型。 ? 温度敏感突变型（高温）是最常用的一类条件致死突变型 基因功能研究、育种 许可温度(permissive temperature) 保持原来正常性状的温度 限制性温度(restrictive temperature〉 非许可温度 (non-permissive temperature) 显现突变型性状的温度 TS突变株 在许可温度下能正常生长，其表型和野生型没有区别；在非许可温度下不能生长或微弱生长，表性与野生型不同。 原因: ? TS突变株的一种重要酶蛋白（例如 DNA 聚合酶、氨基酸活化酶等）在某种温度下呈现活性，而在另一种温度下却是钝化的。 ? 原因是由于这些酶蛋白的肽链中更换了几个氨基酸，从而降低了原有的抗热性。 ? TS突变株在代谢过程中的各个环节，如核酸合成、蛋白质合成、细胞膜或细胞分裂过程中，某种酶的合成或功能由温度所控制 例如，有些大肠杆菌菌株可生长在 37 ℃下，但不能在 42 ℃生长； T4 噬菌体的几个突变株在 25 ℃下有感染力，而在 37 ℃下则失去感染力等。 菌悬液涂布在完全培养基上，置于许可温度下培养 影印到一个完全培养基和两个基本培养基平板上 取基本培养基一皿为一组，置于许可温度下培养； 另取完全培养基和基本培养基各一皿，置于非许可温度下培养 在许可温度的基本培养基上生长，而非许可温度的基本培养基和完全培养基上都不生长； 根据菌落生长情况，可分两大类： 1）非必需基因突变形成的温度敏感突变株 在许可温度下的基本培养基上生长，非许可温度的基本培养基上不生长而在完全培养基上生长。是一类突变引起失去单一酶但可以补偿功能的TS突变株。 2）必需基因突变引起TS突变株 在许可与非许可温度下基本培养基和完全培养基上全部生长，则为野生型菌株。 4、抗反馈调节突变株的筛选 反馈抑制 反馈阻遏 →酶的活性 →酶的合成 调节基因或操纵基因发生突变， 使产生的阻遏蛋白不再能和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因 结构基因突变，使变构酶不再具有结合终产物的能力，但仍具有催化活性 解除反馈阻遏 解除反馈抑制 通常抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株是通过 抗结构类似物突变的方法筛选出来的 ◆ 结构类似物与末端产物结构相似，能与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成，引起反馈调节作用； 但不能代替末端产物参与生物合成 ◆ 抗结构类似物突变株即使在结构