噬菌体随机展示肽库的理论与应用.ppt

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章晓联 教授 武汉大学医学院免疫学系 二 样品的制备和数据的收集 流式细胞仪分析的细胞需要是单细胞悬浮液, 凝集或块状的细胞不适宜流式细胞仪的使用。 全血或Ficoll-Hypaque分离的单核细胞, 用标记的单抗染色, 裂解红细胞 然后在流式细胞仪上, 通过包被细胞的液流的鞘液进行分析。 流 路 单细胞悬液 大多数仪器是在50-300 μm 大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦 FLOW CELL 3-D Histograms 4.临床疾病的诊断及治疗依据 (3)补偿对照(双色或多色分析时) 荧光补偿(compensation)是指在流式细胞多色分析中,纠正荧光素发射光谱重叠(spectral overlap)的过程,即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。需要将单种荧光素标记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色,几色分析就需要制备几个补偿对照管 选择荧光抗体 常用的多色组合: FITC+PE:最常用的双色组合; FITC+PE+PE-Cy5:最常用的三色组合,进行多色荧光染色时荧光光谱重叠补偿很小; FITC+PE+PerCP+APC:最常用的四色组合. 一般PE和APC用于检测表达较低的抗原上,而FITC和PerCP用于检测表达较高的抗原上。 Schematic representation of the Annexin V assay ? FCM分析细胞周期和凋亡: 根据细胞DNA含量的改变 凋亡细胞DNA的降解,凋亡的细胞因核酸内切酶的活性增强,使DNA分裂成一些小片段,这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外,使凋亡细胞的DNA含量相对减少,与荧光染料的结合减少,故细胞DNA荧光强度降低;DNA直方图上显示在G0/G1峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体或称亚G0/G1峰, 又称凋亡峰.通过DNA含量可同时研究凋亡细胞的周期特异性。 利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等) 与细胞内DNA碱基结合,被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光,荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量. 细胞DNA分析原理 细胞周期与DNA的倍体关系 G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 G0 G1 s G2 M DNA Analysis DNA content Count 2N 4N Normal Cell Cycle (2) 机体免疫功能监测的应用例子: 自身免疫性疾病HLA-B27:强直性脊 柱炎相关标志 变态反应性疾病CD23: 与变态反应严重程度呈正相关 FCM在血液, 肿瘤学中的应用; 如白血病, 淋巴细胞瘤的诊断和分类, 肿瘤的监控; 在药理学中的应用. (3) 器官移植后免疫监测 提示排异------- CD3+/CD25+基线5-10%以上 提示肾穿------- CD3+/CD25+持续增加 预测感染------- CD4/CD8比值下降 指导免疫抑制剂应用-- CD4/CD80.2必须停药 提示MCV感染------CD3+/HLA-DR+增加5-10% 不伴CD25增加 (4) AIDS 诊断及治疗监控 标本的制备 免疫标记(膜表面)的样本处理 保证单细胞悬液:组织标本采用机械法、酶法。 300目尼龙网过滤 调整细胞浓度:2~5X106/ml, 标记:取100ul样本 + 适量抗体 孵育:室温避光20分(或根据抗体说明) (加二抗) 溶血:溶血剂的选择(市售、氯化氨、草酸氨) 检测: 标本的制备 免疫标记(细胞浆内)的样本处理 先将细胞膜“打孔” ----破膜 破膜剂的选择:Triton 皂素 毛地黄毒甙 按前述方法进行标记 标本的制备 细胞周期分析的样本处理 传统方法: 单细胞悬液(如全血,则需分离单个核细胞) 冰乙醇固定过夜 洗涤细胞 加复合染液(Triton,RNA酶、PI) 20--30分钟后上机检测 BC公司DNA-Prep试剂 溶血(如需要) 固定染色一步完成 20分钟后上机检测 FCM对照设置 阳性对照:使用已知阳性样本,帮助排除试剂的质量、浓度、特异性以及染色方法等因素造成的假阴性结果。 阴性对照 (1)空白对照:由于存在自发荧光,即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光,需要设立空白对照来去除自发荧光信号(噪声信号)。 (2)同型阴性对照:就是将

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