提取基因组DNA和PCR原理.pptVIP

外周血基因组DNA(gDNA)的提取 破膜： 释放出目的核酸分子 ULtraPureTMgDNA快速抽提试剂盒 二、试剂 纯化树脂（于GN结合液中） GN结合液 漂洗液 离心纯化柱（空柱子） 无水乙醇 TE缓冲液：Tris-HCl（pH7.6) Tris:三羟甲基氨基甲烷 EDTA （pH8.0)乙二胺四乙酸 三、操作过程 1、混匀全血，1ml树脂中加0.5ml全血,颠倒混匀5-6次。室温下温育3分钟，其间颠倒混匀1次，5，000rpm离心3秒，弃上清。 2、加入1mlGN结合液，悬浮上述树脂，颠倒混匀，5，000rpm离心3秒，弃上清。 3、取0.5ml漂洗液漂洗树脂两次,颠倒混匀，5，000rpm离心3秒，弃上清。 如果树脂仍然呈黄色或褐色，重复3步1-2次。 4、加入0.8ml无水乙醇,悬浮树脂,装入离心纯化柱,13,000rpm离心1分钟,倒掉乙醇,再离心1分钟,尽量除尽乙醇。 5、将纯化柱套入一个干净的1.5ml离心管中，加100μlTE于纯化树脂上（不能粘在管壁上），室温下放置3分钟， 13,000rpm离心2分钟。 6、收集离心管中洗脱下来的gDNA，取2μ l电泳 （1%琼脂糖，120V，20分钟）检测。其余-20 ℃ 保存备用。 注意：离心时保持平衡。 7、紫外分光光度计测量核算的浓度及纯度。 （测A260与A280值） 实验前注意事项: 1、所有微量离心管(eppdorf)、枪头（tip）必 须高压灭菌。 2、微量移液器的使用：看清刻度、轻旋、轻放。 3、取不同的试剂、样品须更换tip。 4、纯化树脂（于GN结合液中）为灰褐色粉状 物质，静置时沉淀于瓶底，使用时要充分混匀。 5、室温低于25 ℃时，纯化树脂与GN结合液可能出 现结晶或盐析，请务必预热，完全溶解后使用。 QuickGene Mini80 与DNA全血试剂盒 一、样本抽提前仪器安装准备 1 正确安装好各个仪器配件，接上电源。 2 把试剂盒内的废液管、收集管和带膜的套管放在仪器配件的正确位置上 二、DBS试剂盒第一次使用前准备工作 1 向EDB干粉中添加3.3ml无菌水，混匀室温静置30min 2 向WDB缓冲液中加入160ml无水乙醇 三、样本处理及血液基因组DNA纯化1. 取一新的15ml或50ml离心管，依次加入300ml EDB溶液、2ml全血、2.5ml LDB溶液2. 上下颠倒混匀10次，2500rpm涡旋震荡15sec3. 56℃水浴5min4. 加入2.5ml无水乙醇5. 上下颠倒混匀10次，2500rpm涡旋震荡15sec6. 将处理过的全血倒入QuickGene-610L的带膜的套管内7. 上机，第一次抽提选择模式“DNA WHOLE BLOOD”，按“start”开始8. 第二次抽提选择模式“INSOLUTION A” 四、测DNA浓度与纯度 五、将抽提好的DNA 立即使用或保存于-20℃冰箱中，按实验室说明丢弃其他管子。 PCR定义:polymerase chain reaction ，聚合酶链式反应. 简单的说，PCR就是利用TaqDNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 (In Vitro) 的大量合成。基本上它是利用合成ＤＮＡ的TaqDNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。 PCR的要件 一、基本原理 PCR技术是利用DNA聚合酶在体外条件下,催化一对引物之间特异DNA片段合成的基因扩增技术。包括三个基本过程： DNA的变性(denaturation)： 在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。 解链温度（融解温度，Tm）(melting temperature)： 使50%的DNA发生变性时的环境温度。 DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。 DNA的复性（renaturation)： 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。 2. 影响复性的因素 ① 序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快 ② DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢 ③ 离子强度↑→有利于复性 ④ DNA浓度↑→复性↑ PCR的基本成分： 1 热稳定DNA聚合酶：催化模板依赖的DNA合成。 热稳定DNA聚合酶的选择：主要依据合成大片段DNA产物需要的保真度、效率及合成能力而决定。 常规PCR，TaqDNA 聚合酶是常用酶。 2 一对引导DNA合成的寡核苷酸引物： 设计目的：获得高产率的目的扩增物，抑制非特异序列的扩增。 3 脱氧