实用流式细胞技术及其样品处理.ppt

流式细胞术基本原理 在不同领域的应用 样品及其前处理 一、流式细胞术基本原理 利用流式细胞术可以获得哪些信息 细胞的相对计数、绝对计数 细胞成分的相对定量、绝对定量 单参数或多参数 细胞表面、细胞内成分 可溶性成分 流式分子表型 流式细胞术可以产生哪些信号 细胞的物理参数： 散射光 二、在不同领域的应用 细胞周期分析 细胞功能分析 细胞凋亡分析 免疫学领域 其他领域 （一）细胞周期分析 （二）细胞功能分析 细胞活性分析 细胞膜电位 线粒体膜电位、膜蛋白抗原7A6 细胞内Ca2+ 胞浆内pH 活性氧（ROS） 6、胞浆内pH 活细胞内pH变化范围较小。 某些生物学过程，如细胞分裂及对细胞信号的应答，会出现pHi的变化。 增殖细胞比静止期细胞偏碱性。 （三）细胞凋亡分析 （四）在免疫学领域的应用 2、细胞表面活化抗原的表达 3、细胞因子分析 其他领域的应用 G+：一般不需要额外的处理，便可以吸收大量的试剂。也有例外，如：Walberg等发现，吸入不同的核苷酸染料，也有不同的变化。 G-：细胞膜排斥多数亲脂性或疏水分子，如cyanine染料。EDTA等破膜后，可使亲脂性化合物穿透细胞膜，但是，破膜后的特性与自然状态不同。 三、样品及其前处理 颗粒：细胞 单细胞悬液，避免任何细胞沉积 荧光标记 仪器的限制：激光器、滤光片--荧光素 实验的限制：荧光素组合 2、细胞物理参数的变化 不同的处理和固定方法也可能造成FSC信号的改变。另外，非球形细胞（禽类红细胞）由于其在液流中空间取向不同，也可能导致对同种细胞的FSC信号完全不同。 在可能的情况下，尽量用荧光参数来设门。 3、设门 散射光设门：注意细胞形态的变化 4、荧光补偿 5、红细胞的影响 溶血：不影响表面抗原的标记，常用标记后溶血 6、洗涤效果 7、标记效果 8、实验对照的设计 空白对照 阴性对照：常用同型对照 单色分析：同型对照 多色分析：同型对照、单阳性对照 同型对照：与抗体相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同亚型的免疫球蛋白，用于检测由于抗体非特异性结合而产生的背景染色。 阳性对照：检测阴性时 Fc受体的阻断：与抗体匹配的动物的血清或IgG。 9、细胞数量 统计学意义 计数：106数量级/0.1-0.5ml 非常规检测的样品，调节参数需要消耗一些细胞 需要分析的细胞至少要大于500个。 DNA分析的样品要大于10000个。 11、仪器每次开机的状态都会有一些差异，每次处理的样品也会有所不同，仅有细微差别的实验要在同一次实验过程中完成。 13、样品中的细胞聚集和碎片要尽量少 默认为一个细胞 荧光强度升高 对于细微差别的比较，结果影响较大 DNA样品可用双联体辨别模式（DDM）区分 14、细胞的活性 抗凝剂：肝素 避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程。 PI排除死细胞 16、胞内染色 17、DNA分析 RNA酶处理前后的比较 18、酵母菌的自发荧光 19、细胞分选 鞘液的高压蒸汽消毒 地面、桌面的清洁消毒 室内紫外消毒 仪器管道的清洗 Accudrop beads 影响分选结果的因素 仪器状态 样品：标记抗原、洗涤、过滤 保持细胞活性： 小牛血清 检测过程中遇到的几个问题 测试目的一定要清楚，特别是代替他人测试时：比如，PI标记分析细胞周期、细胞活性或者细胞凋亡； 在检测未染色对照时，需要事先了解多色标记所用的荧光素组合。 FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Fluorescent Intensity Number of Events 荧光强度与结合位点数量成正比（可用百分数和荧光强度表示） 10、单个细胞成分的定量 DCFH染色检测活性氧的产生（多用荧光强度表示） CMF-DA标记检测细胞内酶的活性 12、检测速度 通过改变液流的直径来改变检测速度，液流流速不变。 Laser Time Voltage Highest Time Voltage Laser Lower Time Voltage Laser Lower 根据细胞通过激光照射点的时间，将光信号成比例的转变成电信号 15、弱表达抗原常选用PE标记 CD8: PerCP APC FITC ECD PC5 PE 胞膜和胞内同时表达的抗原: 分别作表面和胞浆内染色。在检测胞浆内抗原时，表面表达必须被控制或视为阴性。 固定破膜不能影响抗原属性或抗原抗体结合率。先固定后染色可能会使表面抗原丢失或改变。 固定：蛋白的交联和变性。 破膜：细胞膜穿孔。1％皂甙 同时测定表面、胞内Ag和DNA含量：膜→胞内→DNA。 膜抗体荧光素不被破膜剂损坏，对胞内抗体，要保证荧光素分子足够小，能进