第三章酶蛋白的化学修饰-公开课件.ppt

第三章 酶的化学修饰 酶的化学修饰（Chemical modification）是指用化学手段将某些原子或化学基团结合到酶分子上，或将酶分子中某基团改变，从而达到改变酶的催化性质及一些生理生化性质的目的。 从酶动力学角度，酶的化学修饰过程为不可逆抑制（激活）过程。 酶的化学修饰广泛用于酶的作用机理研究，医药、农业、酶工程、生化工程等领域。化学修饰具有易实现，作用快，成本低等优点，是一项常用的重要技术。 例如： 1、用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60°C热处理的稳定性增高了1000倍。 2、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、尿酸酶等用PEG修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％－45％。 回顾酶分子的几个部分 肽链：酶分子的骨架，形成基本的空间结构，酶分子的基础。 N端及C端：氨基和羧基有参加催化功能的可能。 侧链基团：是形成活性中心特定构象和性质的组成部分，是完成催化反应的实际参加者。 对侧链基团进行化学修饰是改造酶的性质和功能的重要手段。 ?第一节???化学修饰的方法学 着手蛋白质修饰工作时,首先碰到的是修饰试剂和修饰条件的选择,以期提高修饰反应的专一性,获得满意的修饰结果。 1、试剂的选择 实验目的不同,对专一性的要求也不同,因此,选择试剂在很大程度上要依据修饰目的。 例如,对氨基的修饰有几种情况: ①修饰所有氨基,而不修饰其他基团; ②仅修饰α-氨基; ③修饰暴露的或反应性高的氨基 ④修饰具有催化活性的氨基等。 选择蛋白质修饰剂要考虑的问题: ①修饰反应要完成到什么程度; ②对个别氨基酸残基是否专一; ③在反应条件下,修饰反应有没有限度; ④修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变; ⑤是否需要分离修饰后的衍生物; ⑥反应是否需要可逆； ⑦能否建立快速、方便的分析方法等。 特别注意： 修饰酶活性部位的氨基酸残基的试剂应具备以下特征: ①选择性地与一个氨基酸残基反应; ②反应在酶蛋白不变性的条件下进行; ③标记的残基在肽中稳定,很易通过降解分离出来,进行鉴定: ④反应的程度能用简单的技术测定。 2、反应条件的选择 除允许修饰能顺利进行外,还必须满足如下要求： ①不造成蛋白质的不可逆变性。 ②有利于专一性修饰蛋白质。 为此,反应条件应尽可能在保证蛋白质特定空间构象不变或少变的情况下进行。反应的温度、pH都要小心控制。反应介质和缓冲液组成也要有所考虑。 3.?反应的专一性 专一性非常重要。除控制反应条件外,还可利用其他途径来实现修饰的专一性。 ①利用蛋白质分子中某些基团的特殊性。 例：二异丙基氟磷酸酯(DFP)能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用,迅速导致酶失活。但DFP在同样条件下却不能与胰凝乳蛋白酶原及一些简单的模拟化合物作用。这种现象称为位置专一性,因为这是由于它在蛋白质分子中所处的位置环境所决定的。 ②选择不同的反应pH 蛋白质分子中各功能基的解离常数(pKa)是不同的。所以控制不同的反应pH，也就控制了各功能基的解离程度,从而有利于修饰的专一性。 ③利用某些产物的不稳定性 ④亲和标记 ⑤差别标记 ⑥利用蛋白质状态的差异 第二节 酶蛋白侧链的化学修饰 1、蛋白质侧链上的功能基主要有: 氨基（N端，赖氨酸，精氨酸）， 巯基（半胱氨酸）， 羧基（天冬氨酸、谷氨酸）， 甲硫基（甲硫氨酸）， 咪唑基（组氨酸）， 吲哚基 胍基 2、各基团的化学修饰 （ 1）修饰羧基（三类修饰剂） 1) 碳二亚胺类 + ? 2) 甲醇 + CH3OH HCl +H2O 3）硼氟化三甲烊盐 （CH3）3 OBF4 +