EPO工程细胞大规模培养方法和反应器-公开课件.ppt

EPO工程细胞大规模培养方法和反应器 马佳鹏 刘丽佳 70期生命科学与技术基地班 沈阳药科大学 红细胞生成素(erythropoietin,EPO) 红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是一种糖蛋白,它是红细胞发育成熟过程中的一种最重要的调节因子,它在治疗肾衰引起的贫血中,显示明显的疗效和很小的副作用;在纠正恶性肿瘤相关贫血、艾滋病引起的贫血和化疗引起的贫血等方面,也显示乐观的前景;还可在手术前作为自体输血,从而避免感染血源性疾病等等。因此EPO是很有前途的一种细胞因子 rhEPO的工程细胞 rhEPO (人重组红细胞生成素) 的工程细胞通常使用CHO细胞,因为CHO细胞是重组糖蛋白生产的首选体系,而rhEPO就是一种糖蛋白.CHO细胞是体壁依赖性细胞. 培养基 天然培养基 合成培养基 无血清培养基 无血清培养基 无血清培养基是在合成培养基内加入不同种类的补充因子而替代PBS的培养基. 它避免了血清培养基污染的可能性,并排除了批次间的差别还减少了纯化的难度.但无血清培养基没有广泛的适应性,不同的细胞甚至不同的细胞株和细胞系有各自独立的无血型培养基配方. 补充因子是无血清培养基中各种血清替代成分的总称。补充因子的种类繁多,主要有生物大分子、小分子和微量元素等。补充因子又可归类为必需补充因子和特殊补充因子。 必需补充因子:胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠所有的细胞株在无血清培养基中生长时都需要的, 特殊补充因子:①生长因子②激素③贴壁因子④其它补充因子 1.胰岛素:细胞无血清培养中,胰岛素的使用浓度为0.1~10μg·mL-1。胰岛素可以促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成,抑制细胞凋亡,是重要的细胞存活因子,部分学者认为在批式培养中胰岛素迅速耗尽是细胞比生长速率下降的主要原因。 CHO细胞能在仅含重组人胰岛素一种蛋白成分的无血清培养基中连续传代 2.转铁蛋白:大多数哺乳动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体,受体与转铁蛋白/Fe3+复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源,此外转铁蛋白还具有生长因子的性质并能与其他微量元素如钒等结合。转铁蛋白的使用浓度为0.5~100μg·mL-1,亦有研究报告指出,无血清培养基中必须要有转铁蛋白至少5μg·mL-1,胰岛素才能起作用。也有资料证实转铁蛋白在无血清培养基中的作用可以为某些铁盐所代替,如柠檬酸铁、二甲胂酸铁、葡糖酸铁等。 3.亚硒酸钠:Hewlett在1991年曾指出硒在任何一种细胞,特别是人体细胞的生长过程中确实具有明显作用,微量元素硒参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧化酶的作用过程,消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害。亚硒酸钠的最适添加浓度是30~60nmol·L-1。 生产rhEPO的无血清培养基 用于基因重组促人红细胞生成素(Recombinant human erythropoietin, rHuEPO)生产且不含牛血清白蛋白的无血清培养基-p (Serum free medium-p, SFM-p)培养液,就是在达尔贝可改良的伊格尔(Dulbecco s modified Eagle s medium, DMEM)∶F12 (1∶1)培养基中添加了Se、乙醇胺、多种维生素、蛋白胨、胰岛素、转铁蛋白和一些细胞因子等成分构成的专用培养基 微载体 微载体培养是细胞在由葡聚糖制成的小球表面成单层生长,通过轻轻搅拌使细胞维持悬浮状态。这种培养较传统的单层细胞培养,面积大大增加,将这种微载体在流化床式、固定床式反应器中进行培养,则可获得比原来多20~50倍的高密度细胞. Cytodex微载体上细胞生长情况 Cytopore的性质 动物细胞生物反应器 常见动物细胞生物反应器类型 气升式(airlift)生物反应器 中空纤维管(hollow-fiber)生物反应器 流化床(fluidiz-bed)生物反应器(FBR) 搅拌罐(stir-tank)生物反应器(STR) 固定床(fixed-bed)生物反应器 填充床(packed-bed)生物反应器 填充床生物反应器 动物细胞大规模培养需要合适的生物反应器. 目前国内用的比较多的适合CHO细胞生长并能高效表达产物的反应器是填充床式生物反应器,其中比较有名的是美国NBS公司生产的Celligen系列. Cellgen 系列生物反应器的特点 适合贴壁培养细胞和悬浮细胞,适合各种动物细胞,昆虫细胞和植物细胞等 灌流式的培养过程 低（无）剪切