- 1、本文档共215页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
湖南中医药大学研究生选修课 基因工程概论 基因工程的主要技术 基因工程的酶学基础 基因克隆的载体与受体 目的基因的克隆与分离 克隆基因的检测与功能鉴定 基因工程概论 基因工程的主要技术 基因工程的酶学基础 基因克隆的载体与受体 目的基因的克隆与分离 克隆基因的检测与功能鉴定 复习思考题 试述cDNA文库的特点和构建cDNA文库的一般步骤。 ②氨甲喋啉(Methotrexate)的抑制作用 氨甲喋啉(或氨基喋啉)是叶酸的类似物。 能抑制二氢叶酸还原酶,从而阻断dATP、dCTP和dTTP的合成: dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 ④胸苷酸激酶的补救作用 TK+细胞能产生胸苷酸激酶,所以可以利用培养基中的胸苷(T)合成TTP,存活。 T tk ③次黄嘌呤的补救作用 细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。 dUMP dATP TTP dCTP 次黄嘌呤 补救 氨甲喋啉 抑制 抑制 ① HAT培养基: Tk- 细胞株。 TK基因。 ② 宿主细胞 ③ 载体标记 (2)TK选择过程 含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。(hypoxanthine,aminopterin,thiymidine) 只有转入TK基因的细胞才能生存。 三、酶联免疫吸附测定(ELISA) Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理: 一抗(primary antibody): 与目标分子的特异结合。 二抗(secondary antibody): 与一抗的特异性结合。 酶连(enzyme-linke): 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质(或发光),再通过比色测定有色物质的含量(或光强度),从而推测目标分子的含量。 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 酶 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 无色的底物 有色的产物 比色观察 酶 2. ELISA检测的一般步骤 (1)固定样品 将待测样品加入96孔微量滴定板(microtiter plate)的孔中,干燥后就被固定在孔底。 孔底 加入一抗,反应后冲洗掉未结合的抗体。 (2)一抗结合 一抗 加入二抗,与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 二抗上联着一种酶(碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等)。 (3)二抗结合 二抗 加入无色的底物,被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质(或发光)。 (4)显色反应 在特殊的分光光度仪(酶标仪)上比色,打印出结果。 (5)比色 3.ELISA的局限性 有效,但准确性稍差(主要取决于一抗的特异性)。 必须与其他方法一起综合考虑。 最好用单克隆抗体(monoclonal antibody) 临床检验常用的单抗 四、免疫印迹(western blotting)法 1.原理: 在蛋白质凝胶电泳以后,用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。 (1)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂,使煮沸变性的蛋白质维持线性状态,并与蛋白质结合,使蛋白质带上负电荷。 ① SDS: (SDS): ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE): (Polyacrylamide gel electrophoresis) 在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动,移动的速率主要取决于其分子量大小(链的长短),从而把不同分子量的肽链分开。 电泳buffer 电泳buffer 点样 电泳方向 ③蛋白质电泳的分子量标准 已知分子量的蛋白质混合液,与待测样品一起电泳,为样品蛋白质提供分子量估计。 商品化供应 Da 道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。 一克约为6×1023道尔顿 Dalton SDS PAGE ④凝胶中的蛋白质染色: 考马斯亮蓝: 灵敏度底、只能检出0.3-1μg/带,但可褪色回收。 硝酸银: 灵敏度高、可检出2-5ng/带。 2)转到膜上进行染色。 1)直接染色 直接染色电泳结果 (2)Western blotting 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法,转到膜上(硝酸纤维素膜、膜、中性尼龙膜等)。 ① Western(转膜) 胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。 膜 胶 蛋白 Western装置 ② Blotting 原理与ELISA相同。 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗 辣根过氧 化物酶 底物 产物, 并发出光 PAGE胶 待测蛋白 底片曝光 辣根过氧化物酶:HRPO 1)先用一抗(待测蛋白的单克隆抗体)与 膜上的蛋白结合。 2)洗去未结合的一抗。 3)用二抗与一抗结合(二抗上带有
您可能关注的文档
- 干线输气管道运行管理.ppt
- 广播电视法制化管理及从业人员素质.ppt
- 工作激励与领导行为.ppt
- 临床法医学-腹部损伤.ppt
- 第5讲 课程组织与课程类型.ppt
- 跨文化管理沟通之二:文化冲突与协调.ppt
- 数字图像处理及应用.ppt
- 细胞增殖及其调控方式.ppt
- 异常、模板以及其他高级主题.pptx
- 影响小学生学习智力与非智力因素.pptx
- 2024年中国钽材市场调查研究报告.docx
- 2024年中国不锈钢清洗车市场调查研究报告.docx
- 2024年中国分类垃圾箱市场调查研究报告.docx
- 2024年中国水气电磁阀市场调查研究报告.docx
- 2024年中国绿藻片市场调查研究报告.docx
- 2010-2023历年初中毕业升学考试(青海西宁卷)数学(带解析).docx
- 2010-2023历年福建厦门高一下学期质量检测地理卷.docx
- 2010-2023历年初中数学单元提优测试卷公式法(带解析).docx
- 2010-2023历年初中毕业升学考试(山东德州卷)化学(带解析).docx
- 2010-2023历年初中毕业升学考试(四川省泸州卷)化学(带解析).docx
最近下载
- 内燃机车钳工(中级)职业鉴定理论考试题及答案.doc VIP
- 聚焦贯彻落实新时代党的组织路线存在不足.docx VIP
- 研究生学术英语读写教程(于华)课后习题答案.pdf
- 跨学科实践活动2 自制净水器(同步课件)-【上好课】2024-2025学年九年级化学上册同步精品课堂(沪教版2024).pptx VIP
- 抗凝剂皮下注射相关并发症及处理对策.docx
- 第十章 甲状腺功能减退症PPT课件.ppt
- 《红楼梦的饮食文化》.docx VIP
- PICMG_COMe R3.0原版标准完整.docx
- ERAS加速康复外科在产科应用进展.pptx VIP
- 河南省南阳市六校2021-2022学年高一上学期第一次联合测试地理试题.pdf VIP
文档评论(0)