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免疫共沉淀(co-immunoprecipitation);背 景;Standard Techniques
Glutathione-S-Transferase Fusion Proteins
Affinity Tags
Tandem Affinity Purification (TAP) Tags
Strep-Tag III
Quantitative Proteomics
Chemical Crosslinking
Two-hybrid Yeast
Phage-display
Universal Verification of Interaction Techniques
Co-Immunoprecipitation
Confocal Microscopy
Biophysical Verification of Interaction Techniques
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
GFP-Protein Proximity Imaging Microscopy (GFP-PRIM)
Mass Spectroscopy (MS)
Atomic Force Microscopy (AFM)
Surface Plasmon Resonance (SPR);实验目的;;;;人脑微血管内皮细胞培养于直径为6cm的培养皿,培养大约90%以上融合后,倒掉培养液,PBS洗3次;
加入1ml Lysis Buffer(20mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1%TritonX-100, 1mM β-Glycerolphosphate, 1mM Na3VO4, Cocktail proteinase,pH 7.5),冰上放置30min,裂解细胞;;采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件不一样,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS)。
为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂,低温下进行实验。
Na3VO4作用为保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原。因此在做磷酸化的信号转导时需添加。
;将裂解液转移至EP管中,4℃转鼓摇15min ,14000g 4℃离心15min ;
吸取上清液到新EP管中,每管加1μg 对照兔IgG,同时加入Protein A agarose,4℃转鼓转30min,4℃ 10000g 离心5min;
preclear及其作用
一抗和相应来源的normal mouse, rat, rabbit or goat IgG中有相同或相似的成分(如无关IgG) , 用一抗相应来源的IgG与蛋白裂解液和protein A-agarose可以去除一抗中无关IgG对蛋白裂解液中物质的非特异吸附, 二是可以去除蛋白液中与protein A-agarose非特异结合的物质。做 preclear 的IgG 是不针对特异性抗原的。
琼脂糖珠的选择
SEPHAROSE是注册商品名, 本身是agarose做的凝胶。
;转移上清液至一新管中,将每管总蛋白定量至500-2000 (250-1000) μ g,用lysis Buffer将体积补齐至600-800 μ l。加入AKT兔抗人多克隆抗体10 μ l,4℃ 转鼓过夜(10min);
孵育液体积的控制:考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲液太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。
加入35 μl Protein A agarose,4℃转鼓转2h (10min) ;
1000g 4℃ 离心5min,PBS洗3次,加入40μl 2×SDS Sample Buffer(125mM Tris?Cl pH6.8, 4%SDS, 20%Glycerol, 100mM DTT, 0.02%溴酚蓝)沸水浴中煮沸5min;
Western Blot检测样品,剩余样品-20℃保存。 ;抗体的选择:
1. 使用明确的抗体:实验最需要注意的就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免疫细胞化学染色能结合未必能用在IP反应。仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题,确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;
2.使用对照抗体:
单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗
兔多克隆抗体:正常兔IgG
3. 抗体用量的
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