鸡传染性法氏囊病病毒非编码区结构和5′非编码区缺失病毒突变体构建及其诱导细胞凋亡的分析-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 为了研究ISl)g 1F编码区对其复制和毒力的影响，采_L}j RACE方法，分别扩增了IBDV 超强毒株Harbin一1和细胞适应株CJ801的非编码区cDNA片段H5’A、H3’A、H5’B、 II：j‘Ij利cJ5’A、CJ3’A、cJ5’B、cJ3’B。将8个eDNA片段分别克隆到pGEM—T载体上， 然后进{r序列测序和分析。结果显示，在A节段中，相对于VP5的起始密码子ATG，Harb Jn 1 的5’非编码区包括100个核苷酸；3’非编码区包含95个核苷酸。CJ801的5’非编码 K相对】。VP5的起始密码子是96个核苷酸：它的3’非编码区包含94个核苷酸。在B片 段中，从FP!的起始密码子ATG起始，两个毒株的5 7上游非编码及序列均为11lbp。 Harbin一1毒株B片段的3’非编码区包含79个核苷酸，它的终fr子是TAG，CJ801 包含82个核苷酸，终止子是TAA。序列比较发现，两个毒株A，B节段的5’非编码区 均含有32个核苷酸的高度保守序列和内部核糖体进入位点，以及一些末端重复序列，与国 外报道的参考毒株一致。在A节段的5’非编码区，Harbin一1的5’末端比CJ801多了4 个鸟嘌呤(G)，此外还有2个核苷酸的差异。两毒株的3’非编码区有3个核苷酸的筹异 (T，C，A)。在B节段中，两毒株的5’非编码区有5个核苷酸的变化，(G 52，G59,T6，，A。。和A。，)。 3’非编码区只有G和C 2个核苷酸的差异。与国外已发表的参考毒株的非编码区比较， Harbin一1与超强毒株D6948和HK46同源性最高，具有强毒的特征性核苷酸，而 CJ801与欧洲的细胞适应株关系最近。根据所获得的序列，对IBDV基因组5’和3’非 编码区进行二级结构预测。 超强毒株Harbin—l与细胞适应株CJ801的一级结构差异导致 了-二者截然不同的二级结构，二级结构差异可能与Harbin一1超强的毒力有一定的关系。一 为了研究超强毒株毒力增强的原因是否与非编码区有关，在基因特异性的上游引物引 入T7 RNA聚合酶启动子序列和EcoRI酶切位点，下游引物引入XbaI(A节段)和BamHI(B 节段)酶切位点，采用双融合PCR方法将超强毒株的非编码区和编码区正确拼接，并分别克 隆到pOCl8质粒的相应位点上。通过酶切和末端序列分析鉴定重组质粒，获得了全基因组 eDNA克隆pHCl8一卧和pUCl8一HB，并以此为基础构建了3个A节段5 7非编码区缺失的突 变体pUCl8一}IA△35、pOCl8一}IA△74、pOCl8一眦△94和1个嵌合体pOCl8一C5’／HA的侵染 性克隆。为进一步通过反转录遗传体系来研究5’非编码区对病毒复制和细胞凋亡的影响 奠定了基础。 将超强毒株Harbin一1 A节段及其5’非编码区缺失突变体和嵌合体eDNA克隆用Xba] 线性化，B节段eDNA克隆用SmaI线性化，进行体外转录，分别获得了各自的cRNA。A节段 及其5’非编码区缺失突变体和嵌合体的cRHA分别与B节段cRNA共转染法氏囊原代细胞 和Veto细胞，2天后收毒。转染上清经4次传代．用免疫荧光法检测病毒抗原，结果在法 氏囊原代细胞上检测到了重组病毒(rIBDV)，而在Vero细胞上未能检测到病毒抗原。以重 组病毒为材料进行病毒诱导细胞凋亡的研究，经荧光染色和流式细胞仪检测，发现重组病 毒均能诱导法氏囊原代细胞发生凋亡，但不同的病毒诱导细胞凋亡的能力不同。5 毒均能诱导法氏囊原代细胞发生凋亡，但不同的病毒诱导细胞凋亡的能力不同。5 7非编码 f){：缺失病毒诱导的细胞凋亡率明显低r野生型病毒，5’NCR的突变可能是影响RNA的稳定 性、RNA的复制和病毒蛋白表达的速度，从而影响其诱导细胞凋亡的能力。本实验结果显 ui，IBDV的非编码区不是病毒复制所必需的。此研究为重组IBDV疫苗的研究提供理论依 据。 关键词：啭桑性法氏囊病病毒， 非编商糠， RACE，双融合PCR， 体外转录，复伟§7 ／ 反转录遗传体系， 细胞凋亡， q 2 AbstractTo Abstract To study the difference of non—coding regions between the difference virulence strains and elucidate the role ofNCR s played in replication ofIBDV,the non—coding regions oftwo strains were determined with the method of RACE，and then cloned to pGEM—T vector and seq