蛋白酶活力的测定.doc

实验:蛋白酶的活力测定 实验目的 1、学习蛋白酶活力的测定方法。 2、深入了解酶的活力和比活力的概念。 实验原理 1、酶活力的大小，是以该酶在适宜的温度和pH下，酶催化一定时间后，反应底物的减少量或者反应产物的增加量来表示。 2、本实验蛋白酶的活力大小是以分解出的酪氨酸的量来表示，其单位为：每分钟内分解出1微克酪氨酸的酶量称为1单位。 3、本实验采用福林-酚与蛋白质水解出的酪氨酸生成兰色物，从兰色的深浅程度可以求知酪氨酸的多少，从而确定酶活力的大小。 4、在测酶活力前，先用福林-酚与用已知的不同浓度的酪氨酸作用，作出兰色深浅程度（用光密度表示）与酪氨酸浓度关系的标准曲线。 5、将酶与底物反应产生的产物与福林-酚试剂作用后测光密度，从标准曲线上查出相当于多少微克的酪氨酸，就可以计算出酶的单位了。 三、实验材料、仪器和试剂 实验材料 1398中性蛋白酶粗酶粉（上海新型发酵厂）、滤纸 仪器 （1）试管（1.5*15cm*24) (2)移液管 （3）电热恒温水浴 （4）721型分光光度计 试剂 （1）福林-酚试剂B （2）标准酪氨酸溶液 称取50毫克酪氨酸（预先在105摄氏度烘至恒重），加0.2MHCL溶液后定容至100ml，在加水稀释5倍得到100微克/毫升的酪氨酸溶液。 （3）酪蛋白溶液 称取酪蛋白2克，置150ml三角烧瓶中，加入0.2M磷酸氢二钠61ml，在水浴上搅拌使溶解，再加入39ml0.2M磷酸二氢钠，得到pH7的酪蛋白液，倾出上清液备用。 （4）0.4M三氯醋酸溶液（TCA） （5）0.4M碳酸钠溶液 操作步骤 酪氨酸标准曲线制作： 按下列次序加入试剂，混合均匀，保温，然后在分光光度计上进行比色，测出650nm处的光密度值。 以酪氨酸浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。 管号 1 2 3 4 5 6 酪氨酸100ug/ml(ml) 0 1 2 3 4 5 水（ml） 10 9 8 7 6 5 酪氨酸最后浓度（ug/ml) 0 10 20 30 40 50 混合均匀后，从上面各管各取1ml加入下面各管 酪氨酸溶液（ug/ml) 1 1 1 1 1 1 0 10 20 30 40 50 0.4M碳酸钠溶液（ml） 5 5 5 5 5 5 Folin-酚试剂B（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 迅速混合于40摄氏度放置20分钟 OD650 蛋白酶活力测定 （1）浸出酶液 称取0.5克酶粉加入40ml水，在室温下放置1小时并时加搅动。将酶浸出液过滤，取滤液1ml用水稀释至20ml，即为稀释1600倍的酶液。 （2）酶活力测定 按下表顺序操作： 管号 酶液（ml） TCA (ml） 酪蛋白（ml） 40℃保温10分钟 TCA (ml） 酪蛋白（ml） 40℃保温10分钟 滤液（ml） 0.4M碳酸钠（ml） Folin-酚（ml） 迅速混合40℃保温20分钟 OD 650 0 1 2 0 0 1 1 5 0.5 0 1 1 1 2 1 5 0.5 2 1 1 2 1 5 0.5 3 1 1 2 1 5 0.5 (3)酶活力计算 酶活力光密度值，在标准曲线上查得酪氨酸的微克数，再按下式计算酶活力单位： 蛋白酶活力（单位）=Tyr的微克数*(4/10)*酶液的稀释倍数 注意事项 配置磷酸盐缓冲液时，磷酸氢二钠以含结晶水的为好，不含结晶水的易受潮 配置的福林试剂应为鲜黄色，不带任何绿色，置于棕色瓶中，可在冰箱中长期存放。若此存储液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，恢复原色仍可继续使用。 酶促反应时间要准确控制。