5.--代谢设计育种.ppt

2001年春 张星元：发酵原理（讲座） 2002年春 张星元：代谢设计育种 张星元：发酵原理（讲座） 代谢设计育种 * * 1 代谢设计育种的策划 2 育种方案的实施 代谢设计育种 1. 代谢设计育种的策划1.1 目的产物代谢途径的组合 （五段式）1.2 中心代谢流上节点的分析1.3 理想载流途径的推定 1.4 五字策略的应用 1.1 目的产物代谢途径的组合（五段式） 目的产物合成代谢的“五段式”  1.2 中心代谢流上节点的分析 代谢网络上的交叉点（代谢中间化合物）叫做代谢网络的节点。节点有刚性和挠性之分。挠性节点处的流量分配容易发生改变，任何分支可以得到 100% 的流量。刚性或弱刚性节点的流量分配比例不容易发生改变。 S S P1 P1 P2 P2 P1 I P1 I P2 I P2 I P1 A P2 A 强刚性节点 弱刚性节点 优 尽管代谢网络包含了大量的节点，但通常只有几个节点直接影响产物的转化率，称为主要节点。对赖氨酸生产来说，有五个分支点处流量的分配率受到培养条件较大的影响，它们是 G-6-P、F-6-P、PEP、PYR 及OAA。 在这些分支点中，只有G-6-P 和 PEP / PYR， 被认为是有用的主要节点。通过扰动节点处代谢流量的方法可以做出判断。 PEP PYR OAA G6P 挠性节点 刚性节点 赖氨酸生物合成的网络结构推测试验 Lys AcCoA PYREXT F6P Glc GA6P 网络刚性是自然选择的结果，是细胞经济体系的保障作用的体现。刚性节点是由反馈调节和交叉激活等代谢自动调节机制来支持的，解除调节可望改变节点的性质。然而，代谢自动调节机制不但包括反馈调节和交叉激活。刚性节点的支持背景尚未弄清的时候，只好绕过该刚性节点，先解决其它节点的问题。 根据文献和实验推测。实验包括离线推定和在线推定。 1.3 理想载流途径的推定 N P P 进 出 通 节 堵 1.4 五字策略的应用 节点的刚性取决于微生物代谢的自动调节机制。因此在应用 “ 五字策略 ” 制订育种方案时必须认真分析代谢网络和节点的刚性及其形成的机理，尽量采用协调（如：调节突变株）而不是一刀切（如：营养缺陷型突变株）的手段。 2 育种方案的实施2.1 出发菌种的选定2.2 遗传操作方案的制定2.3 遗传操作方案的实施2.4 变异株培养条件的优化 ※ 调节机制简单：文献 ※ 遗传标记可靠：文献，实验 ※ 生长情况良好：实验，观察 ※ 有目的产物的生产潜力：哲学思辨 ※ 可以获得 ※ 经费方面可行 2.1 出发菌种的选定 ※ 物理诱变 ※ 化学诱变 ※ 复合诱变 ※ 定向诱变 ※ 插入基因拷贝 ※ 插入途径基因组 2.2 遗传操作方案的制定 ※ 缺陷型突变株的获得 ※ 结构类似物抗性突变株的获得 ※ 结构类似物超敏性突变株的获得 ※ 分子生物学方法（略） 2.3 遗传操作方案的实施 ※ 营养因子、酶和功能性蛋白质 ※ 营养缺陷与渗漏营养缺陷突变株 ※ 酶缺损突变株 ※ 输送体系缺损突变株 ※ 条件突变株 突变株的获得 （1）营养因子：氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶（经离心途径合成）。 （2）酶： 中心代谢途径的酶 （ 特别是与生长密切相关的酶 ）、 向心途径的酶、离心途径的酶。 （3）功能性蛋白：调节酶、专一性的输送蛋白、调节蛋白、 以及 电子传递链的多肽成员、ATP 酶等。 营养因子、酶和功能性蛋白质 （1）营养缺陷突变株 （2）渗漏营养缺陷突变株 MM MM+F CM 营养缺陷与渗漏营养缺陷突变株检出 无营养缺陷 其他营养缺陷 F营养缺陷 结构类似物（代谢撷颃物）的选择： 一、空间结构类似， 二、对微生物有致死性或毒性（抑制生长）；绝大多数情况下，结构类似物可被其“真身”解毒。 三、有些抗生素、药物（包括中药）、诱变剂本身就是结构类似物（代谢撷颃物），但需确证。 ※ 结构类似物的确定 ※ 生长抑制试验和敏感性试验 ※ “筛子”的设计 ※ 剂量的确定 ※ 筛选的具体方法的确定 ※ 高产株的检出 结构类似物抗性突变株的获得 结构类似物的确定及其抗性突变株的检出 A’ A A 对照 实验（纸片法） 生长抑制试验和敏感性试验 （1）根据反馈调节机制设计 （2）同时要考虑协同调节机制等 （3）要考虑实验的成本问题 （4）根据问题的轻重缓急设计 “筛子”的设计 （1）浓度梯度平板筛选法 （2）纸片法 （3）