浙江大学生物化学实验甲 蛋白质浓度的测定课程设计.pptVIP

蛋白质浓度的测定 一、福林-酚试剂法测定蛋白质的含量 （Lowry法） ????? 1.1、Lowry法的原理 Lowry法是由两组试剂作用于蛋白质产生有色物质， 通过比色测知其蛋白质含量，这两组试剂包括磷钼酸及磷 钨酸混合试剂（即福林-酚试剂）和碱性铜试剂。其测定 蛋白质含量的原理如下： 蛋白质 碱性铜试剂 铜-蛋白质络合物 （双缩脲反应） 试剂甲 紫红色 一、福林-酚试剂法测定蛋白质的含量 未知样品蛋白含量的测定： 由未知样品的OD650值，通过标 准曲线， 用作图法即可知道未 知样品的蛋白含量，如右图所示。 1.3、Lowry法的特点 Lowry法测得的含量为蛋 白质的相对含量，样品浓度需 按标准曲线进行校正。该法可对2-100微克的蛋白质定 量， 而且操作比较简单，重复性较好，是至今生物化学 研究中应用最多的方法。 Lowry法的缺点是酚类和其它具有还原性的物质对显 色反应有干扰，另外，该法标准曲线线性不是很好，因此 每次测定均需制作标准曲线。 蛋白含量 (ug) OD650 未知 一、福林-酚试剂法测定蛋白质的含量 1.4、材料及试剂 1、实验材料 未知蛋白样品 2、实验试剂 标准蛋白质溶液配制见P89。 福林-酚试剂的配制及注意事项解说见P89。 1.5、实验步骤 实验中的注意事项及解说详见实验讲义P-89。 1.6、试验结果及处理 1、标准曲线的制作。 将所得的试验数据以蛋白含量为横坐标， OD640值为 纵坐标，绘制标准曲线。 一、福林-酚试剂法测定蛋白质的含量 2、未知样品蛋白 含量的确定。 根据未知样品的OD640 值，通过标准曲线求出未知 样品的蛋白含量。 蛋白含量 (ug) OD640 未知 二、紫外吸收法测定蛋白质的含量 2.1、280nm光吸收法测定蛋白质含量 1、 280nm光吸收法的原理 蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸残基具共轭双键的 苯环结构，可吸收紫外光，特征波长275~280nm，因此 可借助280nm的光吸收来测定蛋白质的含量。在一定浓度 范围内，蛋白质溶液在280nm处的光吸收值与其浓度成正 比，可据此通过比色法进行定量测定，可测范围 0.1~1.0g/L。 2、 280nm光吸收法的特点 测定方法简单、灵敏、快速、不消耗样品，低浓度 的盐类不干扰测定，因此在蛋白质和酶的生化制备中广泛 应用，特别是在柱层析分离中，常利用OD280来判断蛋白 质的洗脱情况。 二、紫外吸收法测定蛋白质的含量 由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH值的改变而变化 ，因此测定时应注意溶液的pH值。 3、 280nm和260nm的吸收差法 若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物 质，在用OD280来测定蛋白质含量时，会有较大的干扰。 常用下列经验公式进行估算： 蛋白质浓度（g/L）= 1.45OD280 - 0.74OD260 （假设蛋白质浓度为1g/L时的OD280为1.0。） 4、215和255的吸收差法 利用蛋白质的肽键在200~250nm有强的紫外光吸收 ，并且其光吸收强弱在一定范围内与蛋白质浓度成正比的 性质，利用下列经验公式估算蛋白质的含量： * * 双缩脲反应：由蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。