基因诊断技术的临床应用研究进展.doc

基因诊断技术的临床应用研究进展 摘要：基因诊断技术是以探测基因的存在，分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常，从而达到诊断疾病的一种技术方法。近年来，随着以基因工程为核心的现代生物工程的巨大进步，加快了整个医学界的发展。同时因此基因技术在各种疾病的诊断与治疗中应用广泛。基因诊断方法与传统的诊断方法相比，有着显著的优越性。由于各种优点，基因诊断技术已应用于许多临床疾病的诊断。本文介绍基因诊断技术的概念和常用方法并对近几年对其在临床应用的研究进展进行综述。 关键词：基因诊断；临床检测；分子生物学技术 一、基因诊断的概念和材料来源 基因诊断是以DNA或RNA为诊断材料，应用分子生物学技术，通过检查基因的结构及其表达功能来诊断疾病的方法和过程。其临床意义在于探知DNA或RNA结构变化与否、量的多少及表达情况等，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病诊断或进行基因治疗的依据。 基因诊断材料来源广泛。机体各种组织的有核细胞都可以作为基因诊断的材料。由于大多数单基因病还无法了解它的基因产物异常的性质，用生物化学方法就不能诊断，基因诊断可绕过基因产物，直接检测基因结构的改变。 二、基因诊断的前提 被检测基因是否已在染色体上定位；被检测基因结构是否明确；被检测基因已知的突变类型；被检测基因有无紧密连锁的 DNA多态标记；被检基因的功能及其在疾病发生发展中的作用等。 三、基因诊断技术常用方法 （一）分子杂交技术 分子杂交技术包含核酸的分离与纯化、探针的制备和分子杂交3个步骤。分子杂交包括Southern杂交、Northern杂交、Dot杂交和Western杂交，分别用于检测特定的DNA、RNA和蛋白质。 Southern杂交、Northern杂交和Dot杂交也称核酸的分子杂交，其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在适宜的温度和离子强度下，根据碱基巨补的原则退火形成稳定的异源双链。杂交的过程是高度特异性的，已知核酸片段作为探针并加以标记，用于检测。Western杂交又称免疫学测定，它与核酸分子杂交的区别关键在于探针的性质，用于Western杂交的探针多为单克隆或多克隆抗体，是通过抗原抗体反应进行检测的。分子杂交技术可用于基因克隆的筛选和酶切网谱的制作、基因组中特定序列的定量和定性检测、基因突变分析等方面。 （二）PCR技术（聚合酶链反应） PCR技术又称体外基因扩增技术。PCR的基本原理是人工合成一对20～30个核苷酸的寡聚引物。通过和靶DNA的变性处理，在DNA聚合酶的作用下，以靶DNA为模板，合成引物之问的DNA片段。这个过程是由温度控制的，所以PCR是一个在引物介导下反复进行热变性、退火、引物延伸3个步骤而扩增DNA的循环过程。 （三）DNA测序技术 DNA测序技术主要包括Sanger双脱氧链中止法和Maxam-Gilbert化学裂解法，尤以前种方法常用。Sanger双脱氧链中止法是用放射性同位素标记引物，用双脱氧核苷酸终止DNA链的延伸，产生长度不等的DNA片段，再由高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射至显影读取结果。在各种筛选方法的敏感性和特异性受限时，DNA测序无疑是突变分析的最重要方法。现在的直接测序方法用四 色荧光标记代替了放射性同位素标记，测序自动化程度大为提高，操作简便，但费用高昂。 （四）基因芯片技术 基因芯片技术是一种建立在杂交测序基本理论上的全新技术，该技术是将许多特定的基因片段有规律地排列固定于支持物上，然后通过与待测的标记样品按碱基配对原理进行杂交，再通过检测系统对其进行扫描，并用相应软件对信号进行比较和检测，得到所需的最大信息，进行基因高通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究。它的出现，使基因序列测定、基因功能测定等工作的程序得到了极大的简化。基因芯片技术使用了包括光控同相化学合成、激光共聚焦等在内的多项先进技术，实现了全部自动化，操作极为简便。该项技术，已经在基因多态性分析、基因表达分析等多方面得到了广泛的应用，并已开始应用于临床诊断。 三、基因诊断在临床的应用 （一）病原生物的侵入。 一般侵入体内的病原生物可通过显微镜检查各免疫学方法进行诊断。但是，直接检测病原生物的遗传物质可以大大提高诊断的敏感性。此外，由于基因碱基配对原理的基因诊断可直接检测病原微生物的遗传物质，所以诊断的特异性也大为提高。目前，基因诊断已在病毒性肝炎，艾滋病等传染病的诊断中发挥了不可代替的作用。 （二）结核杆菌的检测。 结核病是长期以来严重威胁人类，特别是发展中国家人民生命健康的常见病，传统的实验室诊断依赖涂片镜检和结核杆菌的培养与鉴定，但阳性率不高，所需时间长。目前应用PCR技术建立诊断方法，敏感度可达到少至100个细菌的水平，且应用针