酶联免疫吸附测定法.ppt

实验原理 双抗体夹心法 双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。? ?? ? 其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。 ? ?? ? 实验器材和药品 　　固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器。 最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙烯 。它们有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。　　微量滴定板，量滴定板为8×12的96孔式。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性增加。 　　酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 酶的底物 1、HRP催化过氧化物的氧化反应。 供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB) OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波长为492nm TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm 2、AP为磷酸酯酶 一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应 阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control) 阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。 阳性对照品在含蛋白保护剂的缓冲液中加入一定量的待检物质 ，含量约为最低检测敏感度的10~20倍。 洗涤液 常用的稀释液为含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液。 酶反应终止液　　 HRP反应终止液为硫酸，一般采用2mol/L AP用NaOH终止 实验方法: 1.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 2.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 3.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。 4.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 5.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。  * * * * 酶联免疫吸附测定法 免疫学实验 基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）