实时荧光定量PCR技术详解及总结.ppt

* | Life Technologies Proprietary Confidential | * 实时定量PCR技术 目录 实时定量PCR基本原理 实时定量PCR实验材料 实时定量PCR实验方法 实时定量PCR实验结果 实时定量PCR基本原理 实时定量PCR的定义 实时定量PCR标准曲线 定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析 实时定量PCR的定义 定量PCR三个基本概念 扩增曲线 指数增长期 平台期 线性增长期 背景期 阈值与C(t)值 阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长期 C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数 Threshold line C(t) value C(t) value 18.12 +/ - 0.04 Threshold line C(t) value C(t) value 18.12 +/ - 0.04 C(t) value 18.12 +/ - 0.04 C(t) value 18.12 +/ - 0.04 定量PCR的数学原理 理想的PCR反应： Xn=X0×2n 非理想的PCR反应： Xn=X0(1+Ex)n 方程式两边同时取对数得: log Xn=log (X0 (1+Ex)n) 整理方程式得: log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn 将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得： log X0= (- log(1+Ex) ) ×C(t)+ log Xc(t) 初始浓度的对数与循环数呈线性关系 n：扩增反应的循环次数 Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 荧光强度---循环数曲线 初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线 104 103 106 105 102 10 初始模板量越多，C(t)值越小 C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系 实时定量PCR标准曲线 定量原理 浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（Ct值）就可分析样品中起始模板量 定量PCR的实验步骤 标准菌株DNA的提取 QPCR探针和引物的设计 阳性克隆质粒的构建 荧光定量PCR反应 定量标准曲线 重复性实验 灵敏性实验 实验材料 * | Life Technologies Proprietary Confidential | * * * 常规PCR重要的是终产物的定性分析，虽然有些能够根据中产物半定量，但是不够精确；实时荧光定量PCR则是伴随PCR反应监测每一个循环的产物量变化，通过对数据的分析达到队初始模板进行精确的定量。 * 介绍图 说明指数扩增的重要性 * 人为规定的阈值，去哪一点计算？消除背景干扰，在指数扩增期内， 是为了引入C(t)值概念 * 并不能解决问题。 1.Xn是荧光值 2.未知数太多 3.Ct重现性