实时荧光定量PCR.ppt

实时定量PCR技术 Realtimequantitativepolymerasechainreaction,RT-qPCR 微生物131沈涛 基本原理： 在RT-qPCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。 在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期。RT-qPCR可行性定量是在PCR扩增的指数期进行的。首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 域值 → Ct ↑ 常规PCR vs RT-qPCR 常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析 RT-qPCR：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析 定量PCR三个基本概念 扩增曲线 指数增长期 平台期 线性增长期 背景期 阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长期 C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数 Threshold line C(t) value C(t) value 18.12 +/ - 0.04 Threshold line C(t) value C(t) value 18.12 +/ - 0.04 C(t) value 18.12 +/ - 0.04 C(t) value 18.12 +/ - 0.04 化学反应原理 依据反应中所选荧光物质的不同,实时荧光定量PCR的化学反应原理通常分为荧光染料和荧光探针两种: 1、SYBR荧光染料: SYBR是一种与双链DNA小沟结合的染料。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料, SYBR荧光染料特异性掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 2、TaqMan荧光探针:该探针是一种寡核苷酸探针。 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团。当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时,Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解,使荧光基团和淬灭基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 SYBR Green I法 结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度 优点 使用方便，无需复杂的设计 成本较低 缺点 与非特异性产物结合，无模板特异性 试验方法较难优化 灵敏度低 TaqMan探针法 水解型 报告基团，淬灭基团 FRET（荧光谐振能量传递） 识别特异性产物 优点 特异性高，可准确定量 灵敏度高 设计不同标记的探针，可进行多重检测 缺点 一个探针只适用于一个目标 价格较高 探针设计较繁琐 两种化学的比较 RT-qPCR的实验设计和数据处理 绝对定量与相对定量 绝对定量 标准品，标准曲线 已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释 根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线 样品 与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值 unknown 104 103 相对定量 相对定量的目的 比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系） 相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别 内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差 特 点： 一般PCR产物都需要经过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭（EB）染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测,不仅需要多种仪器,而且费时费力,所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害处,在这繁杂的实验过程中会带来假阳性的污染。而荧光定量PCR克服了常规PCR的许多缺点,有着如下显著的优点: * * 常规PCR重要的是终产物的定性分析，虽然有些能够根据中产物半定量，但是不够精确；实时荧光定量PCR则是伴随PCR反应监测每一个循环的产物量变化，通过对数据的分析达到队初始模板进行精确的定量。 * 介绍图 说明指数扩增的重要性 * 人为规定的阈值，去哪一点