酵母表达系统.ppt

三 酵母表达系统 （一） 酿酒酵母表达系统 （二） 甲醇酵母表达系统 1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 2、甲醇酵母表达系统的优缺点 3、甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统宿主 甲醇酵母系统宿主 甲醇酵母系统宿主 甲醇酵母系统的整合事件 毕赤酵母系统模式表达载体 1）AOX1位点插入 2）His4位点插入 3） 多基因插入事件（串联整合） 4） 基因取代（GS115，AOX1+） 汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体 甲醇酵母系统胞内表达载体 甲醇酵母系统胞内表达载体 甲醇酵母系统分泌表达载体 甲醇酵母系统分泌表达载体 甲醇酵母系统分泌表达载体 4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 1）载体稳定性 2）基因剂量 3）整合位点 5）mRNA5’端 7）分泌信号 表达载体类型 需要带入ATG 单位点 表达载体类型 需要带入ATG 多位点 信号肽：PHO1 信号肽：MFα 信号肽：MFα 标记：Kan 载体稳定性 基因剂量 整合位点 甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性 同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化： 选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚 外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子 载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。 体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体 外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均可高效表达 毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点的低 4）甲醇利用表型 在分泌表达情况下，甲醇慢生长型更利于表达 mRNA5’端非翻译区（UTR）的组成与长度 应尽量与AOX1/MOX的一致 应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构 6）基因序列的AT含量 AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构 真菌基因工程 三、酵母表达系统 二、酵母转化系统 一、真菌表达系统的优缺点 四、丝状真菌表达系统 甲醇酵母表达系统 酿酒酵母表达系统 其它酵母表达系统 酿酒酵母分泌系统 酿酒酵母系统启动子 酿酒酵母表达系统存在的问题 酿酒酵母糖基化系统 1、酿酒酵母启动子 UAS URS TATA 起始位点 编码序列 mRNA 40-120bp 20-40bp 100-1400bp 1、转录起始位点； 4、URS：上游阻遏序列 2、TATA盒：富含AT； 5、DAS：下游激活序列 3、UAS：上游激活序列; DAS 1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH 磷酸甘油激酶基因PKG 乙醇脱氢酶基因ADH 酿酒酵母表达系统常用启动子 2）半乳糖激酶启动子（GAL1） GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 A、 GAL1、GAL7和 GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控 B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录 C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差 半乳糖诱导、葡萄糖抑制 2）半乳糖激酶启动子（GAL1） GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录 半乳糖诱导、葡萄糖抑制 Promoter GAL10 3）pho4TS-PHO5启动子 A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录 B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子 C、pho4TS 温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭 D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达 低温诱导、磷酸盐抑制 酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源： 性结合因子：MF-α 酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL 2、酿酒酵母分泌系统 *保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用 *信号肽结构： 酿酒酵母信号肽特点 正电荷区 疏水区 极性区 Met 目的蛋白 信号肽剪切位点