分子克隆实验流程.doc

分子克隆实验流程 一、引物的稀释 1、引物干粉冻存于-20℃，用前12000rpm离心1min； 2、按引物管上的nmol数稀释，nmol=4.92，加49.2μL ddH2O至100μM； 3、稀释至10μM（5μL引物F+5μL引物R+40μL ddH2O） 二、目的基因的扩增 实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。 扩增体系： Reagent 25μL 50μL 10xbuffer (含Mg2+) 2.5μL 5μL dNTP (10mM) 0.5μL 1μL rT aq酶 0.25μL 0.5μL primer (10μM) 1.25μL 2.5μL Template DNA 2μL 4μL ddH2O 18.5μL 37μL 反应程序：（延伸时间按目的片段大小进行调整） 95℃ 预变性3min （95℃ 变性30 s，60℃ 退火30s，72℃ 延伸45s）x35 72℃后延伸 7min 4℃保持 电泳：120V，加2μLloading buffer，上样5μL，1000bp marker 5μL 小胶：2%，0.6g琼脂糖，30ml 1xTAE 中胶：2%，1g琼脂糖，50ml 1xTAE 大胶：2%，2g琼脂糖，100ml 1xTAE 三、目的产物切胶回收（试剂盒） 四、连接 实验前准备：SolutionI在冰上融化 连接体系： Reagent 10μL 胶回收DNA(50ng/μL) 4μL PDM-18T载体 1μL Solution I 5μL 反应条件：16℃，4h（PCR仪，热盖105℃）/ 4℃过夜 五、转化 实验前准备：开启42℃水浴锅 实验步骤：样品+阴性对照（无质粒）+阳性对照（感受态带的质粒） 1、把感受态细胞TOP10从-80℃冰箱拿出并放置于冰上解冻； 2、每管分装30 - 50μL感受态细胞（冰浴）； 3、向感受态细胞中加入5μL连接产物，冰浴30min。 4、42℃热激90S（时间不能太长，也不能太短）后静置于冰浴3min，加入750μL无抗生素的LB液体培养基，37℃ 200rpm恒温震荡培养1h 5、4000 rpm离心2min，弃上清同时保留50μL混匀菌体沉淀后均匀涂布于抗性平板上。 6、37℃恒温培养过夜。（16 LB（amp）抗性平板的制备 配方： 胰蛋白胨 3g 5g 酵母提取物 1.5g 2.5g 氯化钠 3g 5g 琼脂 4.5g 7.5g ddH2O 300mL 500mL 121℃高压灭菌20min，降温加入氨苄（amp）抗生素（amp：LB=1:1000） 六、摇菌 实验前准备：生物安全柜紫外照射30min 实验步骤： 1、取出过夜培养的LB固体培养基平皿，观察是否有菌落长出。 2、取3ml LB液体培养基于15ml管中，已经加入抗生素（氨苄），氨苄：LB培养基=1:1000（即：3μL amp+3ml LB）。 3、在15ml管上做好标记，分别加入从LB培养基上挑取的单个菌落，37℃ 250rpm恒温震荡培养过夜（8小时以上 ）。 七、菌液PCR（目的基因引物+载体引物） 实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。 反应体系： Reagent 20μL 10xbuffer (含Mg2+) 2μL dNTP (10mM) 0.25μL primer (10μM) 0.5μL Template DNA 2μL rTaq酶 0.25μL ddH2O 15μL 反应程序： 95℃预变性 3min （95℃变性30s，60℃退火45s，72℃ 72℃ 后延伸7min 4℃保持 九、测序PCR 实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、（BD+5xbuffer）Mix提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。 反应体系： Reagent 10μL （BD+5xbuffer）Mix 2.1μL 模板DNA（纯化产物） 3.5μL primer (10μM) 0.75μL ddH2O 3.65μL 反应程序： 96℃ 1min, (96℃ 10s, 50℃10s, 60℃ 3min) x30 4℃ 十、质粒提取、菌种保存、浓度测定: