可溶型三聚体血管生长抑制因子Kringle5的克隆表达纯化及活性研究.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，３１（３）：１８２２ ? 可溶型三聚体血管生长抑制因子Ｋｒｉｎｇｌｅ５的 克隆，表达，纯化及活性研究 妙　亮　徐立华　冀　胥　边六交 （西北大学生命科学学院　西安　７１００６９） 摘要　血管生长抑制因子Ｋｒｉｎｇｌｅ５是目前发现的抑制血管内皮细胞增殖和肿瘤生长的活性最强的纤 溶酶原片段，特异性高而毒副作用小，在肿瘤的治疗方面具有潜在的巨大价值和广阔的应用前景。根 据Ｋ５基因的序列设计ＰＣＲ引物，通过ＰＣＲ从已有的克隆载体扩增出人纤维蛋白溶酶原的Ｋ５部分基 因，将Ｋ５基因克隆入原核表达载体ｐＥＴ１５ｂ，经序列测定，成功构建了ｐＥＴ１５ｂＫ５非融合表达载体。将 重组载体导入大肠杆菌中ＩＰＴＧ诱导表达，ＳＤＳＰＡＧＥ分析目的蛋白主要以可溶形式存在于菌体中，破 碎后上清通过阳离子交换层析，纯化获得纯度大于９５％的目标蛋白，脱盐后对分子量测定推测形成了 三聚体。通过鸡胚绒毛尿囊膜法证明蛋白产物对鸡胚绒毛尿囊膜血管增生有一定的抑制作用。 关键词　Ｋｒｉｎｇｌｅ５　克隆　分离纯化　生物活性 中图分类号　Ｑ７８９ 　　血管新生对于肿瘤的生长有着重要的作用，若能抑制 ｐＥＴ３２ａＫ５，大肠杆菌 Ｔｏｐ１０、ＢＬ２１（ＤＥ３）和质粒 新生血管的生成，则可有效阻断瘤体的营养，进而抑制肿 ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）均为本实验室保藏。 瘤的增殖与转移，因此寻找能高效抑制血管生成的物质， １．１．２　试剂　琼脂糖、ＤＮＡ分子量标准，北京天根生 阻断肿瘤血管的形成，是目前肿瘤治疗研究领域的一大热 化科技有限公司；ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＤＮＡ连接酶、内切 ［１］ 点 。血管再生是一个包括内皮细胞迁移、附着、膜降解 酶，Ｐｒｏｍｅｇａ公司；质粒小量提取试剂盒、基因凝胶回收 和新血管生成的多步骤过程。血管抑制素人纤维酶原具 试剂盒，Ｏｍｅｇａ公司；快流速 ＳＰ琼脂糖凝胶 （Ｓ 有五个结构类似的环，人纤维酶原被激活切割后形成的两 ＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．；０．７ ２．５ｍｍｉ．ｄ．）预装柱，ＧＥ公司  部分都具有抑制血管增生的作用，前四个联环区（Ｋ１Ｋ４） 产品；低分子量蛋白Ｍａｋｅｒ（１４．４～１１６ｋＤａ），Ｆｅｒｍａｎｔｓ 被称为ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ，Ｋ５是最后一个联环区结构，与ＫＩ，Ｋ２， 公司；蛋白Ｍａｋｅｒ（１０～２２５ｋＤａ），纽英伦生物技术（北 Ｋ３，Ｋ４都有较高的同源性。与ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ相似，Ｋ５也是一 京）有限公司。主要试剂，如酵母提取物、蛋白胨、异丙 ［２４］ 种内皮细胞增殖的特异性抑制剂 。研究成功构建了重 基硫代Ｄ半乳糖苷（ＩＰＴＧ）等均为分析纯。其他试 β 组菌 Ｅ．ＣｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ１５ｂＫ５，对重组蛋 白质 剂均为分析纯或化学纯。５～７天鸡胚购自养鸡场。 Ｋｒｉｎｇｌｅ５的分离纯化工艺进行了研究，初步检测了活性，为 １．２　方　法 后续的药物开发研究奠定了一定的基础。 １．２．１　寡核苷酸引物的设计与合成　根据 Ｋｒｉｎｇｌｅ５ １　材料与方法 ＤＮＡ序列，设计了能从重组质粒ｐＥＴ３２ａＫ５中扩增出 Ｋｒｉｎｇｌｅ５基因的上下游引物，并在其中分别加入了Ｎｃｏ １．１　材　料