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荧光分光光度法测定蔬菜中的西维因残留 姓名： 班级：食品科学 学号： 一 目的要求 1 通过实验强化对荧光分光光度法定量分析原理的理解； 2 通过本实验增强弱荧光分析物荧光强度的方法强化对理论课所述相关内容的理解； 3 直观了解荧光分光光度计的结构； 4 掌握荧光激发光谱和荧光发射光谱的测定方法； 5 掌握利用标准曲线法进行定量分析的方法。 二 实验原理 西维因（1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯），又名甲萘威，是氨基甲酸酯类杀虫剂的一种，常用于水果、蔬菜、棉花、谷类作物生产中。西维因是一种中等毒性的农药，可使体内的胆碱酯酶失活，从而造成乙酰胆碱的蓄积，导致中毒现象的发生。我国规定其在蔬菜中的最大残留限量为2.0 mg/kg。 在碱性条件下，西维因将会水解，定量生成具有较强荧光的1-萘酚以及甲胺和二氧化碳，反应式如下： 阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)的加入可使1-萘酚的荧光强度进一步增强，该荧光强度与样品中的1-萘酚浓度，也就是西维因的浓度存在线性关系，通过测定其荧光强度可确定样品中西维因的残留量。 西维因是一种具有触杀和胃毒作用的杀虫剂，内吸作用极小，在喷施后，其残留绝大部分都存在于作物表面，不会渗透到组织液中。在对其残留进行提取时，采用有机溶剂淋洗样品表面的方法就可以将其残留有效提取出来，这样可以避免对样品进行匀浆处理导致色素进入样品溶液并干扰测定的现象发生。采用标准曲线法进行定量分析时，可对西维因标准溶液系列进行上述反应，通过测定该系列的荧光强度，制作回归标准曲线，再以样品中西维因残留的质量浓度通过测定所得到的荧光强度，回带到回归曲线算得其中西维因残留。样品有两种，另一份是加了0.5ml标准中间液，做加标回收率计算。 三 仪器与试剂 1 仪器 Cary Eclipse型荧光分光光度计；pHS-2型酸度计；BS 124S电子分析天平。 2 试剂 氢氧化钾、CTMAB、磷酸氢二钾（K2HPO4·12H2O）、无水乙醇为分析纯试剂，西维因标准品含量98%。 四 实验步骤 1 试剂配制 氢氧化钾溶液：称取0.56 g氢氧化钾溶于水中，稀至1000 mL，浓度为0.01 mol/L。 CTMAB溶液：称取36.44 g CTMAB溶于水中，稀至1000 mL，浓度为0.1 mol/L。 磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钾42.27 g，溶解于500 mL 0.2 mol/L KOH溶液中，最后用蒸馏水稀释至1000 mL。此溶液pH12，浓度0.1 mol/L。如果pH达不到12，在定容前可继续加入KOH溶液，直至到达设定值再定容。 西维因标准储备溶液：称取0.0010 g西维因用乙醇溶解并转移至100 mL棕色容量瓶中，用乙醇稀至刻度，储存于4 ℃保存。此溶液浓度为0.0100 g/L。 西维因标准使用溶液：临用前吸取西维因标准储备溶液1 mL于100 mL棕量瓶中，用乙醇稀至刻度，此为0.1 μg/mL的标准中间液。将此溶液用乙醇稀释10倍即为0.01 μg/mL的标准使用溶液。 2 标准溶液系列和样品制备 标准溶液系列制备：吸取西维因标准使用溶液1、2、3、4、5 mL于10 mL具塞比色管中，加入氢氧化钾溶液1 mL，于60℃水浴中水解30 min。加入CTMAB溶液2 mL及pH12的磷酸盐缓冲溶液1 mL，用水定容，充分振荡，于室温下反应40 min后测定。 样品制备：称取20 g叶菜2份，分别放入烧杯中，其中1份分别加入0.5 mL标准中间液（0.05μg）做加标回收率实验。所有样品中均加入3 mL乙醇，用滴管吸取乙醇反复淋洗叶菜表面，将洗脱液移入10 mL比色管，用标准溶液制备方法制备。 3 测定 激发及发射单色器狭缝的光谱通带均设为5 nm。使用1 cm荧光液池，以空白调零，对标准溶液系列最高浓度的溶液扫描激发光谱和发射光谱。 以此条件测定标准溶液系列，每个标准溶液重复测定3次，记录荧光强度数据；用同样条件测定样品溶液的荧光强度，每个样品重复3次，记录样品荧光强度数据。 4实验结束后，按要求关好仪器。 五 结果处理 1 对记录的标准溶液系列中的每一个标准溶液的3次荧光强度求平均值，对该系列的荧光强度平均值和浓度值进行线性回归，获得标准曲线方程F=a+bC中的a和b。该项工作亦可利用仪器的功能在仪器上完成。 2 对测定的样品溶液的3次荧光强度求平均值，将该值代入F=a+bC中，得到样品的结果，根据样品的取样量计算出样品及加标样品中西维因残留以mg/kg为单位的含量。该项工作亦可利用仪器的功能在仪器上完成。 3 加标样品的加标回收率可按下式计算： 回收率%=[(加标样品测定值-样品测定值)/加标样品中的加入量]×100% 六 注意事项 1 该方法是通过水解反应将西维因转