PM表型芯片技术在微生物相关研究领域中应用1.ppt

* * 美国Biolog公司根据其多年对全自动微生物鉴定系统相关技术的积累，开发了一种全新的专利技术——表型芯片技术（以下简称PMs）。PMs可用来测定微生物细胞的表型，是与DNA芯片和蛋白质组技术并列的、应用在基因组研究和药物开发的三大技术之一。PM技术可以允许以同一标准模式同时高通量测试上千种细胞表型，非常高效、快速。通过对活体细胞测试，可以检测细胞基因变化后或用药后所引起的细胞表型的变化情况。该技术测试活体细胞在用药或基因改变后细胞层面表型的变化，可以对通过分子方法如DNA芯片和蛋白质组分析获得的数据作重要的补充。 * * * osmolarity?克分子渗透压浓度摩 * * 传统表型分析：相对孤立，实验繁琐，周期长，耗费大量人力、物力。 * * 每个孤立的测试均需单独进行代谢曲线的比较。 * * PMs系统在96孔微孔板（PM平板）的每个孔里固定不同的干化细胞培养基质和氧化还原显色物质，当加入微生物细胞悬液并培养后，细胞表型就可以通过颜色变化表现出来。如果微生物发生代谢，那么就可以将显色剂从无色的氧化态还原为紫色的还原态，表型反应为阳性；如果无颜色变化，则表型反应为阴性。微孔板的培养和读数由OmniLog培养箱/读数仪完成，系统可定时自动测定颜色变化值，最后得到表型反应的动力学曲线，从而定量测定表型反应的强弱。样品的动力学曲线（显示为绿色）及对照的动力学曲线（显示为红色）通过系统中软件的数据计算、处理后叠加在一起。有相同动力学曲线的重叠区域被标记为黄色，而有差异的表型部分则很明显的显示出来（红色/绿色）。 * * 2000个测试仅需一个小时左右的人工操作，剩下工作完全由OmniLog PM System自动完成，24-48小时候即可获得结果，系统自动标记出有差异的测试。 * * * * * * 细胞呼吸——染料变色 * * * * 染料vs浊度，具有较好的线性关系 * * 490nm吸光度vs Ominlog信号，线性关系同样很好，所以PMs系统用专用的氧化还原染料颜色的深浅来反映细胞代谢的程度是能获得比较准确信息的。 插入或是敲除一段基因后有没有达到预期的目的，或是细胞表型发生了更多我们没有预想到的变化，这都是我们非常感兴趣的。而使用PMs可以非常容易的察觉到这一切。 * 分析已经功能的基因表达情况 * * * MG1655（基因组测序菌株） 衍生菌株通过插入Tn10（抗四环素）转坐子而敲除了malF基因。malF基因编码与麦芽苷摄取有关的蛋白，所以我们期望观察到Tn10转坐子与麦芽糖代谢和四环素耐药有关的表型缺陷。PM分析检测发现两种表型的改变：丧失麦芽糖、麦芽三糖和糊精代谢以及具有抗四环素属性。（PM11-PM20中有些孔是多种化学物质的混合或是不同梯度）  * * * * PM分析E.coli b1012操纵子被敲除后氮代谢发生的变化，图中只显示了PM3板的结果，突变菌株不能利用胞嘧啶、尿嘧啶和尿苷。 B1012操纵子被标记在E.coli基因芯片上，被氮调节蛋白C高度调控。 b1012是E.Coli K12的操纵子，对嘧啶降解途径起调控作用。 * * * * 检测生产菌株的表型差异可以作为优化生长条件的一种手段； 3株E. coli 生产菌株同参照的母系菌株比较 * * 对于有颜色的抗生素，可直观通过颜色来判断某种物质对抗生素产量的影响。也可以取每个微孔板上的菌液做抑菌圈分析，判断各种物质对抗生素产量的影响。 * 针对不同实验，20种分析板不一定全部使用，应该使用最合适的板子进行测试。 * * * Biolog通过对革兰氏阴性菌和阳性菌的近2000种表型测定，选定了2种表型反应，用在Gen III鉴定板上，这样在新一代的Gen III鉴定系统中，有了这2个反应，不再对好氧细菌进行革兰氏染色，减少鉴定的前处理工作量。 * * * * 选择最适合的测试，小型化PMs系统 PM Pattern OmniLog PM System PM Kinetic Result 1 hr setup automatic 24-48 hr 2000 种表型测试1-2天完成测试 PHENOTYPE MICROPLATES表型分析微孔板 表型芯片测试组 Carbon Nitrogen (peptides) Phosphorous Sulfur Biosynth. Pathways pH Chemical Sensitivity Metabolic Sensitivity Nitrogen (amino acids) Osmotic Ionic 细胞呼吸涉及的常见表型反应(已报道的) Dyered (Colored) 有色的染料 Growth NADH 电子在细胞膜或线粒体上转移 无色的染料 P S 转