抗猪γ-干扰素单克隆抗体制备与定量抗原捕获ELISA检测方法初步建立.ppt

硕士研究生论文答辩 抗猪γ-干扰素单克隆抗体的制备及定量抗原捕获ELISA检测方法的初步建立 报告内容 研究背景 研究思路与策略 试验方法及结果 讨论 小结与展望 研究成果 研究背景 ?-干扰素（IFN-?）是机体内具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的重要细胞因子。它主要由激活的T细胞、激活的NK细胞和巨噬细胞产生。 猪IFN-?全基因编码166个氨基酸残基，包括20aa的信号肽(Dijkmans,1990)。 信号肽切除后，产生146aa的IFN-? 单体，分子量为17.3kD，天然活性 状态的IFN-?是由两个IFN-?单体经 非共价交联形成的同源二聚体糖 蛋白(Boehm,1997)。 IFN-γ的细胞分泌机制 MHC II+抗原递呈细胞将抗原肽递呈给CD4+T细胞,使幼稚CD4+T细胞转化为具有IFN-γ分泌功能和增殖能力的效应Th细胞。 MHC I+抗原递呈细胞将抗原肽递呈给CD8+T细胞，使后者转化为具有IFN-γ分泌功能和增殖能力、靶细胞杀伤功能的效应CTL细胞。 NK细胞和巨噬细胞被病原体所携带的LPS激活后，亦能分泌IFN-γ。 IFN-?检测的免疫学意义 机体的细胞免疫状态监测 药物的疗效评估 细胞免疫功能分析 病原体T细胞表位鉴定 IFN-γ的免疫学检测方法 抗原捕获ELISA 酶联免疫斑点试验 免疫聚合酶链式反应 细胞内细胞因子流式细胞术 实时荧光定量RT-PCR ELISPOT 原理 卵黄抗体的免疫学特性 对细菌及哺乳动物蛋白抗原具有很高的亲和力 不与细菌或哺乳动物Fc受体结合，因而不能激活补体系统 不与哺乳动物血清中的类风湿因子反应，与哺乳动物IgG和IgM没有交差反应 疏水性比IgG强，因而更容易包被于ELISA板和乳胶微球表面 稳定性好 生物素-亲和素系统 生物素-亲和素系统是70年代末期发展起来的一种新型生物放大系统，其具有以下几个显著特点： 高灵敏度：由于每个亲和素分子可结合4个生物素分子，其结合常数高达1015mol/L，远远大于抗原抗体的结合常数（105-11mol/L），因而该系统具有放大作用，能显著提高检测的灵敏度。 高特异性：亲和素和生物素的结合反应很强，并具有高度专一性。加上系统的高灵敏性，因而使试剂经得起高倍稀释，从而大大减少了通常免疫反应中出现的非特异性作用。 高稳定性 ：亲和素与生物素一旦结合就很难解离，酸、碱、有机试剂、蛋白酶等均不影响二者的结合作用。 本试验研究目的和意义 本研究旨在应用生物素-亲和素放大系统，以单克隆抗体和卵黄抗体为基础, 建立一套检测猪IFN-?的定量抗原捕获ELISA方法，为进一步建立猪IFN-?的ELISPOT检测方法奠定基础。 研究思路与策略 研究报告 单抗的Western-blot鉴定 1.预染蛋白质分子质量标准(Fermentas) ; 2.重组猪IFN-γ 3.猪IFN-γ 标准品（RD systems) ; 4. BSA 单抗的间接免疫荧光（IFA）分析 卵黄抗体效价测定 抗原特异性IgY的纯化 生物素标记的卵黄抗体的制备 生物素标记卵黄抗体的效价 抗猪IFN-?单克隆抗体的纯化 单克隆抗体包被浓度的选择 生物素标记卵黄抗体工作浓度的选择 封闭剂的选择 rpIFN-?检测标准曲线 灵敏度的确定 特异性试验（一） 目前只对商品化人IFN-γ 样品进行了特异性试验。应用本系统检测106IU/mL的该样品的OD450平均值为0.086，而阴性对照的平均值为0.059，因而可判定为无交叉反应。 特异性试验（二） 应用本试实验所建立的检测系统和商品化的检测小鼠IFN-?的ELISPOT试剂盒检测经系列稀释的ConA样品。 临床检测 应用本ELISA方法对四头接种rPRV-HA猪连续四周的免疫血清进行?-干扰素检测。 讨 论 本实验以带有融合标签和信号肽的rpIFN-?为抗原，以rpIFN-?和不含任何庸余序列的猪IFN-?标准品交叉对单克隆抗体进行筛选和鉴定，既节省了昂贵的标准抗原，又减少了单克隆抗体筛选过程中不必要的时间浪费 本实验采用免疫亲和层析的方法从小鼠腹水中纯化单克隆抗体，从而保证了所得抗体的特异性 用鸡作宿主,高滴度抗体出现时间早，持续时间长，因而可实现抗体的大规模生产 ConA能结合含α-D-呋喃甘露糖和α-D-呋喃葡萄糖糖基的糖蛋白或多糖，而抗体分子，辣根过氧化酶（HRP）富含甘露糖残基，这可能就是本实验建立的ELISA方法对ConA产生交叉反应的直接原因 结