GB/T 19915.7-2005猪链球菌2型荧光PCR检测方法.pdf

CCI5s307.010.30 荡黔 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB/T 19915.7-2005 猪链球菌2型荧光PCR检测方法 Methodofthereal-timePCRforthedetectionofStreptococcussuistype2 2005-09-27发布 2005-11-01实施 串替裳臀瓣譬篷臀臀暴发“ GB/T19915.7-2005 前 言 本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。 本标准由国家标准化管理委员会提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口． 本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国兽医药品监察所。 本标准主要起草人：张鹤晓、宋立、高志强、宁宜宝、乔彩该、王甲正、杨承槐、吴丹、谷强。 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T19915.7--2005 猪链球菌2型荧光PCR检测方法 1 范围 本标准规定了猪链球菌2型荧光PCR检测方法。 本标准适用于增菌培养物、疑似病料及生猪拭子、猪组织样品中猪链球菌2型的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日期的引用文件，其随后所有 的修改单 不（包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检侧方法 3 缩略语 本标准采用下列缩略语： 荧光PCR 荧光聚合酶链反应 Ct值 每个反应管内的荧光信号盘达到设定的阅值时所经历的循环圈数 DNA 脱氧核糖核酸 Taq酶 TaqDNA聚合醉 PBS 磷酸盐缓冲生理盐水 4 原理 采用TagMan方法，在比对猪链球菌2型英膜抗原21基因c（ps2J）序列的基础上，设计针对该基 因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光素为报告荧光基团 用（R表示）,3’端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团用（Q表示），它在近距离内能吸收5端‘荧光基 团发出的荧光信号。PCR反应进人退火阶段时，引物和探针同时与目的荃因片段结合，此时探针上R 基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5 -3’的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而 被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 5 猪链球菌2型黄光PCR检侧实脸盆的标准化设tI与曹理 猪链球菌2型荧光PCR检测实验室的标准化设置与管理见GB/T19438.1-2004中附录C, 6 试荆和材料 6.1试剂 除另有说明，所用试剂均为分析纯。 6.1.1 无水乙醇：一20℃预冷。 6.1.2 75％乙醇：用新开启的无水乙醉和无DNA酶的灭菌纯化水配制，-200C预冷。 6.1.3 0.0lmol/LpH7.2的PBS：配方见附录A,(121士2)C,15min高压灭菌冷却。 GB/T19915.7-2005 6.1.4 猪链球菌2型荧光PCR检测试剂盒”：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录B, 6.2 仪．设备 6.2.1高速台式冷冻离心机：最大转速13000r/rnin以上。 6.2.2 荧光PCR检测仪、计算机。 6.2.3 20C-8℃冰箱和一20℃冰箱。 6.2.4 徽量移液器：0.5IAL-10KL,5pL-20uL,20liL-200