实验3质粒DNA的提取与鉴定ppt课件.ppt

质粒DNA的提取、定量酶切与鉴定;实验内容;实验目的;;独立于细菌染色体外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子； 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多．;碱裂解法 煮沸裂解 羟基磷灰石柱层析法 质粒DNA释放法 酸酚法等 ;分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离质粒DNA;基本原理 ;☆原理示意图;2、离心层析柱;（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5α? （三）试剂： LB培养基（液体、固体） Bioteke质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）;50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris·Cl(pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块;0.2 mol/ L NaOH 1% SDS 作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 注意：时间勿太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次;5mol/L 乙酸钠 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS＋线性DNA沉淀，Na＋可中和DNA 注意：复性时间不宜过长 ;菌液;;;;限制性内切酶（restriction endonuclease）是DNA操作过程中所使用的基本工具。 特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。 分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。;限制酶的切割点因酶而异，有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段,如HaeIII,有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ. ;★ 平末端在识别顺序的中心对称轴处切割;★ 3’端粘性末端在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3’末端切割。;5’ G-A-A-T-T-C 3’ 3’ C-T-T-A-A-G 5’;双酶切限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER 如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer； 如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和。;Buffer的选择查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表; 酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul。 以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外该酶可分解15μg的DNA。 ;;影响酶切反应的因素;紫外光吸收法 ;计算方法: 因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。 ;记录OD260值，通过计算确定DNA浓度，公式如下: 质粒DNA(?g /ml)=50×(OD260) × 稀释倍数 ; 根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度（Ratio=A260/A280）;实验仪器;数据处理;菌体老化 碱裂解不充分 菌体中无质粒 溶液使用不当;混有蛋白 混有RNA 混有基因组DNA ;定量检测 ;; 天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose ，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。 琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。 ;琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动. DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系). ; 1、 DNA的分子大小 2、 琼脂糖浓度 3、 DNA分子的构象 4、