诺如病毒标本处理和实验室检测技术方案.ppt

2015年版 目录 前言 诺如病毒完整的检测及分型流程包括标本前处理、RNA 提取、Real-time RT-PCR 检测、传统RT-PCR 检测、测序和基因分型6 个步骤。Real-time RT-PCR 方法灵敏度和准确度高，是检测诺如病毒的金标准。用传统RT-PCR 可对Real-time RT-PCR 阳性标本的PCR 产物进行测序，通过序列分析确定诺如病毒的基因群和基因型。在发生聚集或暴发时，ELISA 方法可作为辅助的手段快速检测诺如病毒抗原。食品、水、环境涂抹样检测方法的灵敏度不稳定，仅作为参考方法。 1 标本前处理 1 标本前处理 1.1 粪便、呕吐物 1.1.1 设备和材料 微量移液器、无菌过滤器、漩涡振荡器、微量离心机、1.5ml 无菌离心管、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）10mM pH7.0-7.4。 1.1.2 操作方法 （1）离心管每管分装0.5mlPBS。用一次性移液管（或无菌棒）添加豌豆大小的粪便（约0.1 克），稀释成约10％至20％（重量/体积）的粪便悬浮液。当粪便样品是液态时，不必在PBS 中稀释，直接使用500ul 的样品。 （2）漩涡振荡每个样品1 分钟。在5000 rpm 下 1 标本前处理 离心5 分钟，使得固体沉淀。澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或贮存于-70℃。 （3）取澄清的上清液200ul 进行RNA 提取。 1 标本前处理 1.2 水 通过阴离子滤膜过滤水样品。用牛肉膏（1.5%w/v）含0.05M 甘氨酸（pH9.0）缓冲液洗脱附在膜上的病毒。使用Microsep 100TM 或CentriconTM columns 离心管进一步浓缩洗脱液。 1.2.1 设备和材料 DEPC 水、新配制次氯酸盐（至少1%）或等效消毒剂、MilliporeHA filter（孔径0.45um、）、换膜过滤器、真空泵、计时器、PH 值酸度计、磁力搅拌器及转子、低温冰箱（-20℃、-70℃）、Microsep 100K columns（PALL 公司）、Centriprep YM-50（Millipore 公司）、洗脱液（BE-0.05Gly pH7.0）、PBS (pH7.2)、离心机、 1 标本前处理 氯仿、丁醇。 1.2.2 操作方法 1.2.2.1 过滤装置准备 （1）使用无菌的镊子将滤膜放在滤器架上，滤膜有三层，型号分别为Millipore HA filter、AP15 和AP20，放置顺序为Millipore HA filter→AP15 →AP20。 注意：暴露出滤膜表面使其能与水样接触，请将滤膜光滑表面的那边向下。所有的玻璃器皿应干净无菌。每批水样使用不同的漏斗。 1 标本前处理 （2）将滤膜置中，将有刻度的漏斗放在滤器的上边。 （3）使用不锈钢滤器夹进行水的密封。 （4）真空泵连接1000ml 的锥形瓶。 注意：为防止气溶胶的污染，应在无菌的环境中过滤，在生物安全柜进行操作。 （5）向滤器中倒入20ml 无菌水（DEPC 水）检查滤膜的密封情况。 （6）打开泵，调整水的流速至形成缓慢的细流。 1 标本前处理 1.2.2.2 水样品的过滤 （1）向玻璃漏斗里倒水样，当水样完全滤过立刻关闭真空泵。 （2）用不锈钢的滤器夹，小心移开滤膜上的刻度漏斗。 1.2.2.3 用酸漂洗滤膜 将膜用无菌的镊子夹放在有200ml 0.05mM H2SO4（pH3.0）的无菌500ml 烧杯中进行漂洗滤膜去除Mg2+。 1.2.2.4 洗脱 （1）将膜夹出放在无菌的60mm 培养皿中，加 5ml 洗脱液。盖上铝箔。 1 标本前处理 注意：要将滤膜的上边向下（倒置）放在锥形瓶里。 （2）将锥形瓶放在恒温摇床上，转速45rpm，室温（23℃± 3℃），15min。 （3）关闭摇床，将洗脱液（大约5ml）转移到管子里。 1.2.2.5 中和洗脱液 用1N HCl 或1N NaOH 调整洗脱液的pH 到7.0-7.4。检测前，洗脱液在-70℃储藏。 1.2.2.6 二次浓缩 1 标本前处理 方法一：用Microsep 100 K columns 或Centriprep YM-50 浓缩病毒 （1）为防止病毒的附着，先用无病毒粒子的洗脱液浸湿过滤器。 （2）将水标本滤膜洗脱液（大约5ml）加入到浓缩柱中，5000rpm离心5min。 （3）吸取浓缩液（约150μl），转移至1.5ml 离心管中。 1 标本前处理 方法二：PEG 沉淀 （1）向标本洗脱液中加入NaCl 终浓度是0.3mol/L（若洗脱液为5ml 加0.08775g 的NaCl）, 有助于病毒的沉淀，再等量加入PEG-6000终浓度为12.5％（w/v）（若洗脱液为5ml