柚CCoAOMT基因的克隆与超表达载体构建.PDF

中国农学通报 2014,30(25): 148-153 Chinese Agricultural Science Bulletin 柚CCoAOMT基因的克隆与超表达载体构建 1,2 1,2 1,2 徐 玉 ，潘腾飞 ，潘东明 1 2 （福建农林大学园艺学院，福州350002 ；福建农林大学园艺产品贮藏保鲜研究所，福州350002） 摘 要：为探明咖啡酰辅酶A-O- 甲基转移酶（CCoAOMT ）在柚[Citrusmaxima(Burm.) Merr.]果实发育中 对木质素单体合成的影响，克隆了柚CCoAOMT基因ORF 序列并构建超表达载体转化至农杆菌。采用 Trizol 法提取柚汁胞总RNA ，经反转录得到cDNA ，根据已知柚CCoAOMT 片段序列，设计其ORF 引 物。PCR 扩增得到柚CCoAOMT 基因ORF 序列，长度为744 bp ，编码247 个氨基酸，与龙眼(Dimocarpus longan) 、麻疯树(Jatropha curcas)、杨树(Populus balsamifera)的CCoAOMT基因同源性大于90%。经软件 预测，该酶定位于质膜的可能性最大，不具有跨膜结构。将柚CCoAOMT 基因正向导入植物过表达载体 p 1301，位置在CaMV35S 启动子的之后，并将载体转化至农杆菌EHA 105。本研究得到的基因片段包含 柚CCoAOMT 基因ORF ，成功构建植物超表达载体p 1301-cmCCoAOMT ，并导入农杆菌。含p 1301-cm CCoAOMT 的农杆菌株可转化多种植物受体，为深入研究该基因功能奠定了基础。 关键词：柚；克隆；CCoAOMT基因；载体构建 中图分类号：S666.3 文献标志码：A 论文编号：2014-0400 CloningofCaffeoyl-coenzymeAO-methyltransferaseGenefromCitrusmaxima(Burm.)Merr. andItsPlantExpressingVectorConstruction 1,2 1,2 1,2 XuYu ,PanTengfei ,PanDongming 1 (CollegeofHorticulture,FujianAgriculturalandForestryUniversity,Fuzhou350002; 2InstituteofPostharvestScienceandTechnologyofHorticulturalProducts,FAFU,Fuzhou350002) Abstract: Toprobetheeffectsofthecaffeoyl-coenzymeA 3-O-methyltransferaseonligninbiosynthesisin granulatedpummelojuicesac,acmCCoAOMT genewasclonedfrompummelojuicesacandconstructedinto plantexpressingvector,andthenwastransformedintoAgrobacteriumtumefaciens.TotalRNAwasobtainedby Trizolmethod,andwasreversetranscribedascDNA.cmCCoAOMTgenewasclonedbyPCRwithaprimerpair desi