单克隆抗体制备实验过程.doc

WORD整理版 参考学习资料 单克隆抗体制备实验过程 一、 免疫动物  免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。 说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。 PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。 2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。 3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。 二、细胞融合 （Cell fusion） 【材料和试剂】 （1）骨髓瘤细胞悬液 选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。 （2）免疫小鼠脾细胞悬液 取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108 个脾细胞。 饲养细胞 将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105/ml，备用。 主要试剂的配制 ①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4℃保存。 不完全RPMI-1640培养基： RPMI-1640培养基原液 96ml 100×L.G.溶液 1ml 双抗溶液 1ml 7.5%NaHCO3溶液 1-2ml HEPES溶液 1ml 不完全DMEM培养基： DMEM 13.37g 超纯水或四蒸水 980ml NaHCO3 3.7g 双抗溶液 10ml 100×L.G.溶液 10ml 用1N HCl调试PH至7.2-7.4，过滤除菌，分装4℃保存。 完全RPMI-1640或DMEM培养基： 不完全RPMI-1640或DMEM培养基 80ml 小牛血清 15-20ml HT或HAT培养基： HT培养基 HAT培养基 完全RPMI-1640或DMEM培养基 99ml 98ml HT贮存液 1ml 1ml A贮存液 1ml ②氨基喋呤（A）贮存液（100×，4×10-5mol/L） 称取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。 ③次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液（100×，H：10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L） 称取136.1mg次黄嘌呤（Hypoxanthine，MW 136.1）和38.8mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine，MW 242.2），加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶