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SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
一、前言
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳,简称PAGE,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。 HYPERLINK /doc/391243-414301.html \t _blank 催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂,以 HYPERLINK /doc/6877362-7094813.html \t _blank 四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发 HYPERLINK /doc/5395218-7117649.html \t _blank 丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维 HYPERLINK /doc/13232-13664.html \t _blank 网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和 HYPERLINK /doc/1458907-1542447.html \t _blank 分子筛效应。不连续系统中由于 HYPERLINK /doc/4519680-4729645.html \t _blank 缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及 HYPERLINK /doc/4150630-4350502.html \t _blank 分离胶所组成。浓缩胶是由AP HYPERLINK /doc/391243-414301.html \t _blank 催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。
SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。而强 HYPERLINK /doc/722002-764387.html \t _blank 还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的 HYPERLINK /doc/6722416-6936505.html \t _blank 二硫键断裂。在 HYPERLINK /doc/6023117-6236114.html \t _blank 样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被 HYPERLINK /doc/9056636-9387450.html \t _blank 解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS HYPERLINK /doc/6051997-6265016.html \t _blank 胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS一般采用的是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后,HCl解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低 HYPERLINK /doc/6768370-6983484.html \t _blank 电导区,而 HYPERLINK /doc/3568219-3752438.html \t _blank 电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成一稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。
此鉴定方法中,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关。
聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。它有两种形式:非 HYPERLINK /doc/4150054-4349906.html
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