课件：酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体.ppt

Company Logo Company Logo 小组成员：王哲鉴、钟 鑫 陈 阳、刘一宁 指导教师：綦 霞 所在院系：检验医学院 Company Logo 摘 要 1 实验方法 2 结果讨论 3 4 致 谢 Company Logo 目的：检测伤寒O抗体一般采用肥达实验（直接凝集实验），在临床诊断中有重要的意义。能否建立一个用酶联免疫吸附法检测血清中抗伤寒“O”抗体的实验体系，提高临床诊断效果是本实验要解决的关键问题。 原理：以伤寒O抗原免疫动物，制备出抗伤寒O抗体，将后者纯化，与酶连接制备成酶标抗体，以伤寒O抗原包被酶标板，以制备的伤寒酶标抗体为竞争抗体，可以构成竞争法检测伤寒抗体的酶联免疫实验。 结果：成功建立了一个酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体的实验体系 结论：酶联免疫吸附法可以检测血清中抗伤寒“O”抗体 实验材料： 实验动物：家兔（1.性格温顺，一般不咬人，但其爪锐利，挣扎时易抓伤操作人员 2.与伤寒沙门菌种属差异大，可保证产生抗体 3.体重大，血量多，得到的血清可保证实验顺利进行） 实验试剂：饱和硫酸铵溶液 PBS透析液 辣根过氧化物酶(HRP) NaIO4溶液 2.5%乙二醇溶液 硼氢化钠溶液 包被稀释液 酶标抗体 待测抗体 稀释液 洗涤液 底物液 实验器材：兔笼 透析膜 离心机 加样器 酶标板 Company Logo Company Logo 1 2 3 4 制备伤寒O抗体 纯化 抗体 酶与抗体的连接 ELISA 竞争检测 伤寒O抗 体（预实验 和正式实验） 颗粒性抗原伤寒杆菌 备注 第一周 第一天 耳缘静脉注射0.1ml 之前取血0.7-1ml，分离血清，待用 第二天 耳缘静脉注射0.2ml 第三天 耳缘静脉注射0.2ml 第四天 耳缘静脉注射0.5ml 第二周 加强免疫：皮下注射1.0ml（两侧各0.5ml） 第三周 耳中央动脉采血，分离血清 1份血清（5ml）+ 1份生理盐水 + 2份饱和硫酸铵 置试管中 2000转离心20min 弃上清 1.5~2ml NS 溶解沉淀 透析24h 收集、标记、冰冻 5管 缓缓摇动 ,室温2h（1.5h） 盐析法 实验原理：NaIO4是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分（与酶活性无关的部分）的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合，形成酶标抗体，反应式如下： 实验方法： 标记过程： 1.将HRP 5mg溶于0.5 ml PH5.6 HAC-NaAc 缓冲液中（老师做）。 2.滴入NaIO4 0.25ml,此时酶的颜色由黄变绿。4℃作用30min。 3.加入2.5%乙二醇溶液0.5ml（稳定剂）终止反应，室温30min 。 4.加入待标Ab1.5~2.0ml,用pH9.5碳酸盐缓冲液调整反应液的pH至 9.0左右，4℃过夜。 5.加入0.1ml硼氢化钠，4℃2小时。 6.pH7.4 PBS液透析过夜，收集、标记成酶标记抗体和冻存 （一）.酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体预实验 1.包被Ag：抗原（伤寒）用包被液稀释，每孔加入100μl，置37℃作用4h或4℃作用24h。 2.洗涤：弃去孔中液体，洗涤液洗涤3次，每次1min，于吸水纸上充分拍干。 3.加入样品：每孔加入酶标Ab及Ab各100μl，放入37℃恒温箱中孵育30min。（如图1） 4.洗涤：同上 5.加入底物液：每孔加入底物液A1滴、B1滴，避光放置约5-15min，密切观察。 6.终止反应 待测 酶标 原液 1：5 1：25 1：125 阴性 对照 1：25 1：50 1：100 1：200 （图1） 选择每一排阴阳色差最明显者为最佳工作浓度 稀释方法： 1.酶标抗体 1:25——1200ul(牛奶）+50ul（酶标）=1250ul 1:50——600ul(牛奶）+600=1200ul 1:100—— 600ul(牛奶）+600=1200ul 1:200——600ul(牛奶）+600=1200ul 2.待测抗体 1:5——600ul(牛奶)+150ul(待测)=750ul 1:25——600ul(牛奶)+150ul=750ul 1:125——600ul(牛奶)+150ul=750ul