课件：分子肿瘤概论(研究生课件).ppt

* * * * 设置的对照包括： 在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 3.GST沉淀实验（GST-pull down实验） 主要是用来证明细胞外蛋白质相互作用 利用GST (Glutathione-S-transferase， GST)和谷胱甘肽亲和树脂之间的高亲和性 将GST固化在树脂上 GST和谷胱甘肽转移酶蛋白在细菌、动物细胞等体系中融合表达 固化的诱饵蛋白【即诱饵蛋白(Bait protein)】可以捕获细胞裂解物中的互作用靶蛋白 洗脱结合物后通过western blot 检测诱饵蛋白和靶蛋白,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白 4.Far-Western blotting 在经典Far-Western印迹中，运用经标记的或可被抗体检测的“诱饵”蛋白检测转移膜上的“猎物”靶蛋白。 用SDS或非变性PAGE分离含有未知靶蛋白的样品（通常为细菌裂解液）然后转膜。 转膜后与已知诱饵蛋白孵育，运用该诱饵蛋白的特异性检测系统检测。（出相应条带+） 5.生物信息学 （三）基因拷贝数、转录产物mRNA异常 核酸分子生物学方法进行检测 核酸变性、复性基本性质 常用方法 1. 核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridisation）技术 最常用的基本技术 基本原理： --标记的已知碱基序列 （DNA或RNA单链片段） （探针probe ） （同位素　P32 I125 　 非同位素 生物素 地高辛 荧光素） --检测靶核酸（待测核酸）中是否存在与之 同源的序列 （1）原位杂交 （ISH） （2）荧光原位杂交 （FISH）， （3）双色（多色）银染原位杂交（DSISH） （4）Southern blot (DNA 杂交) （5）Northern blot (RNA 杂交) 2. 聚合酶链反应（polymerase chain reaction , PCR）技术 又称体外基因扩增 利用DNA变性和复性原理 体外进行 特定的DNA 片段高效扩增 获得或放大特异基因信号的重要手段 扩增产物的检测 凝胶电泳分析 琼脂糖凝胶电泳 (最常用) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 单一条带 Real-time PCR RT-PCR 3.基因芯片技术 (四)基因突变的检测方法 1.聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products , PCR-SSCP） 长度相同，构象不同 在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳 迁移率（泳动率）不同 碱基序列不同的单链DNA构像改变 基本方法 作PCR 将产物变性而成为单链 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 显示结果 可用同位素/荧光素标记 非同位素标记 2.PCR-限制性片段长度多态性（restrection fragment length polymorphisms , RFLP）分析技术 基本原理 --序列中一个碱基发生改变 --使原来的内切酶位点消失 或产生新的酶切位点 --用限制性内切酶消化PCR 扩增出来的DNA片段 --检测其酶切片段长度的差异 3.变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 基本原理 电泳时，不同浓度凝胶温度不同 DNA链中有一个碱基改变 在不同的温度发生解链 电泳迁移率改变 4. DNA 序列分析（DNA sequencing ） 5. 荧光原位杂交 ( FISH) 6． DNA 芯片技术（DNA chip ） （五）肿瘤的微卫星不稳定性分析 微卫星不稳定性（microsatellite instability , MI）, 是指简单重复序列的增加或丢失 PCR + DNA 序列凝胶电泳 （六）肿瘤易感性检测 采用相应基因变异方法进行检测 （七）肿瘤相关病毒 核酸杂交技术与PCR技术 (八) 基因重组技术 主要目的是获得某一基因或DNA片段的大 量拷贝 (九) 基因转染（gene transfection）技术 （十）RNA干涉(RNA interference） 核酸杂交/PCR技术与蛋白表达【免疫组化/荧光、流式细胞术、WB方法结合、蛋白结合检测方法 】