肝细胞癌N-糖链的结构改变及其机制研究-生物医学工程专业论文.docx

Classified Index: R85 U.D.C.: 575.224 Dissertation for the Doctor Degree in Engineering THE STUDY ON THE STRUCTURAL CHANGES OF N-GLYCANS AND RELATED MECHANISM IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA Candidate: Liu Xia Supervisor: Prof. Li Yu Academic Degree Applied for: Doctor of Engineering Specialty: Biomedical Engineering Affiliation: School of Life Science and Techonogy Date of Defence: October, 2013 Degree-Conferring-Institution: Harbin Institute of Technology - - I - 摘 要 摘 要 肝细胞癌（HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其病情进展快、预后 差，因早期诊断困难、治疗手段有限而死亡率高。因此，研究其发生发展的分 子基础，寻找 HCC 早期诊断生物标志物和潜在治疗靶点，对 HCC 的诊断和治 疗具有重要意义。 糖蛋白糖链参与细胞识别、信号传导、免疫监视，维持着多细胞生物体各 项有序性生命活动。糖链的异常改变通常与多种疾病包括肿瘤的发生发展密切 相关。对恶性肿瘤特异性糖链结构与功能的研究不仅可以揭示糖链的生物学功 能，还能为肿瘤生物标志物的筛选和新药靶点的开发奠定基础。DSA-FACE 技 术是本世纪初新兴的糖生物学检测技术，因其高通量、高灵敏度的特点，目前 已在肿瘤血清生物标志物研究中得到足够认识，但利用该技术对非血清样本的 研究则少有报道。 本文从糖生物学角度、利用 DSA-FACE 技术对 HCC 特异性 N-糖链结构及 其发生异常改变的分子机理进行研究，以期为 HCC 的早期诊断、恶性演进和 转移预测提供生物标志物，为 HCC 靶向治疗靶点选择及基于糖链结构改变的 恶性转化机制研究奠定基础。在研究中，首先优化了血清糖蛋白 N- 糖组 DSA-FACE 检测技术，有效提高了其检测效率。在此基础上，建立了可用于体 外培养细胞系及临床组织样本细胞表面 N-糖组分析技术，通过分析膜蛋白不同 制备方法（去污剂法和超速离心法），并引入石墨化炭黑（GC）树脂纯化技术、 优化研究体系，使得该技术对于细胞表面 N-糖组的检测更加灵敏、可靠，并具 有良好的可重复性，从而拓展了 DSA-FACE 技术的应用范围，突破了以往只用 于检测血清样本 N-糖组的局限性。 在优化 N-糖链检测技术的基础上，本文分析了北方地区 190 例 HCC 患者 血清样本，以 110 例乙肝病毒感染者及 179 例健康人血清样本作为对照。结果 发现，由血清中三个发生异常变化的 N-糖链 NGA2F、NGA2FB 和 NA3 联合获 得的 Log[(NGA2F+NGA2FB)/NA3]指标对于 HCC 的诊断准确性可达 85%，诊 断灵敏度和特异性分别可达到 71.1%和 86.0%，且该指标的诊断准确性不受患 者性别、年龄、肿瘤病理分期、癌细胞分化程度等因素影响。深入分析本研究 中 40 例 AFP 处于正常值范围（AFP 20 ng/mL）的 HCC 患者血清，结果显示 有 23 例血清中 Log[(NGA2F+NGA2FB)/NA3]指标明显高于阈值（0.1045），证 明该指标可有效降低 AFP 对于 HCC 的漏诊率。进一步利用 Logistic 回归分析 - - II - 哈尔滨工业大学工学博士学位论文 法建立基于血清特异性糖链（NGA2F、NGA2FB、NA3）与 AFP 的联合诊断模 型，ROC 曲线分析表明，联合诊断模型对于 HCC 的诊断准确性可达到 94.8%。 该结果证实，以血清 N-糖链生物标志物为基础的联合诊断模型可作为我国北方 地区 HCC 特异性的普查生物标志物。 利用本文建立的细胞表面 N-糖组 DSA-FACE 技术完成 88 对临床 HCC 组 织样本细胞表面 N-糖组分析。结果表明，与癌旁对照组相比，峰 L10（NA3FB） 在 HCC 细胞表面显著性增加（p0.0001），而峰 L6（M8）在 HCC 细胞表面显 著性降低（p0.0001）。这两个 N-糖链在不同性别、年龄及癌细胞分化程度的 患者中均表现出显著性改变，并于 HCC 发病早期就具有明显改变的趋势。此 外，通过与具有不同组织来源及性别差异的 100 对乳腺癌组织细胞表面 N-糖组 的比较，NA3FB 在