《微生物制药新微生物药物的筛选》课件.ppt

第二章 微生物制药 目的——将产生菌的一些有益变异，通过不断的筛选和培育，为研究和生产提供更多合乎需要的高产优质新菌种。 冷冻干燥保藏 液氮超低温保藏法 菌种保藏在液氮超低温（-196℃）中，是目前比较理想的一种菌种保藏方法。 适用于各种菌种的保藏，特别适于难以冷冻真空干燥等方法保藏的菌种。 保藏期较长，菌种的变异较小。 投资费用较大，并要一个可靠的氮源。 繁而高效 15年 各大类 超低温（－196℃），有保护剂 液氮保藏法 繁而高效 5~15年 各大类 干燥、低温、无氧，有保护剂 冷冻干燥保藏法 简便有效 约1～10年 产孢子的微生物 干燥，无营养 砂土保藏法 较简便 约10年 细菌，酵母菌 低温（－70℃），保护剂（15～50％甘油） 甘油悬液保藏法 简便 约1～2年 各大类** 低温（4℃），阻氧 石蜡油封藏法* 简便 约6～12月 细菌，酵母菌 低温（4℃），避氧 冰箱保藏法 （半固体） 简便 约1～6月 各大类 低温（4℃） 冰箱保藏法 （斜面） 评价 保藏期 适宜菌种 主要措施 方法 7种常用菌种保藏方法的比较 *用斜面或半固体穿刺培养物均可，一般置于4℃下。 **对石油发酵微生物不适宜。 5、菌种保藏的注意事项 菌种在保藏前所处的状态 菌种保藏所用的基质 操作过程对细胞结构的损害 摇瓶初筛 ↓ 挑出高产斜面 ↓ 菌种保藏（砂土管、冻干管或制备固体孢子） ↓ 摇瓶复筛（复筛次数及摇瓶数以及培养基种类根据情况决定） ↓ 挑出高产菌株 作稳定性试验和菌种特性考察 ↓ 放大试验罐、中试考察 ↓ 大型投产试验 传种斜面（或直接用固体孢子） ——对照组 ——对照组 突变株的筛选方法 一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。 淘汰野生型菌株的方法有： 抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。 营养缺陷型菌株的检出方法有： 逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。 影印平板（Replica plating）法是Lederberg夫妇在1952年建立 6-氟色氨酸 Pseudomonas aureofaciens（金色假单胞菌） 吡咯叠氮（pyrrolnitrin） 三氟-DL-亮氨酸 S.typhi 亮氨酸 对氟苯丙氨酸 E.coli 酪氨酸 乙硫氨酸 Escherichia coli（大肠杆菌） 甲硫氨酸 6-甲基色氨酸 Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌） 色氨酸 3-乙酰吡啶 Chlamydomonas eugametos（一种衣藻） 烟碱酸 2，6-二氨基嘌呤 Salmonella typhimarium（鼠伤寒沙门氏菌） 腺嘌呤 6-硫鸟嘌呤 Corynebacterium sp（一种棒状杆菌） 肌苷 8-氮鸟嘌呤 Bacillus pumilus（短小芽胞杆菌） 肌苷 抗代谢物 产生菌 代谢产物 用梯度平板法定向培育若干代谢产物的高产菌株 根据形态变异淘汰低产菌株，根据平皿反应挑取高产菌株。 摇瓶筛选法 琼脂块筛选法 筛选自动化和筛选工具微型化 随机筛选 理性化筛选 运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。 理性化筛选 初级代谢产物高产菌株的筛选： 降低终产物浓度 筛选抗反馈突变菌株 次级代谢产物（主要是抗生素）高产菌株的筛选： 利用营养缺陷型筛选 筛选负变株的回复突变株 筛选去磷酸盐调节突变株 筛选去碳源分解代谢调节突变株 筛选氨基酸结构类似物抗性突变株 筛选二价金属离子抗性突变株 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 筛选自身所产的抗生素抗性突变株 降低终产物浓度 杂交育种——一般指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。 真菌、放线菌和细菌均可进行杂交育种。 3、杂交育种 1）常规的杂交育种 遗传标记 异核体形成 杂合二倍体的形成 染色体交换和单倍体 2）原生质体融合 A.标记菌株的筛选 供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。 采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。 通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。 B.原生质体的制备 在高渗透压溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。 （细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处理， 酵母菌和霉菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶） 溶菌酶 蜗牛酶 影响原生质体制备的因素： 菌体的预处理 菌体的培养时间 酶浓度 酶解温度 酶解时间 渗透压稳定剂 用EDTA、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨