《纳豆激酶在家蚕幼虫中表达及纯化》-毕业论文.docVIP

纳豆激酶在家蚕幼虫中表达及纯化 家蚕杆状病毒表达系统是一个真核的表达系统，它和其他表达系统（大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞）相比，其中一个最大的优势是：可以在家蚕的幼虫和蛹体内表达外源基因，而且体内表达水平要比体外表达高50－1000倍（Miyajima et al 1987）。家蚕幼虫在5龄时每条蚕可达5g以上。在本章中，我们在家蚕幼虫中表达了纳豆激酶基因，并用免疫沉淀的方法对表达产物进行了纯化。 1. 材料与方法 1.1 材料 家蚕品种：青松×皓月，购自浙江省海宁市盐官镇农村。桑叶购自浙江大学动科院试验桑园。HRP标记的羊抗兔IgG购自华美生物工程公司；牛血纤维蛋白原、牛血纤溶酶原和凝血酶等购自中国药品生物制品检定所；洛欣（注射用尿激酶）购自广东天普生化医药股份有限公司；Protein A 抗体纯化预装柱购自Amersham Biosciences公司。蛋白质标准蛋白分子量（94.4～14.4 kD）购自申能博彩公司。其他化学药品为国产分析纯试剂。 1.2 方法 1.2.1 在家蚕幼虫中表达纳豆激酶 五龄起蚕在饷食前，每蚕用微量加样器注入5μL重组病毒Bm-BacPAKNK。接种后的家蚕在26－28℃、通风透光场所，用桑叶饲养。每隔24 h采集蚕血，待蚕出现明显的病毒感染症状后，大批量采集蚕血。为了防止采集的蚕血氧化变黑，蚕血中加入0.1%八羟基喹啉。 1.2.2 表达产物ELISA检测 取接种重组病毒Bm-BacPAKNK的蚕血淋巴，阴性对照（Bm-BacPAK6病毒感染的家蚕幼虫的血淋巴）用包被液适当稀释后，取100μL包被酶标板，37 ℃温育4 h或置于4 ℃ 18 h以上。用包被液包被的孔作为空白对照。一抗为第一章中制备的兔抗多克隆抗体血清1:1000稀释使用。 1.2.3 蚕血淋巴中纳豆激酶的SDS和Western blotting 鉴定 制备用于Western 印迹分析的SDS凝胶。 电泳结束后，剪6张与PVDF大小一样的滤纸，用电转移缓冲液润湿后将其中三张滤纸完全重叠平铺于电转移装置上。然后将转移缓冲液洗过的SDS凝胶平铺在滤纸上，再将经甲醇（2-3S）和水（约1.5 min）处理的PVDF膜平置于凝胶表面，用一根玻璃棒在PVDF膜上轻轻滚动，去除气泡。 将另3张滤纸平铺于PVDF膜表面，用玻璃棒在滤纸上轻轻滚动，去除气泡，然后将滤纸/凝胶/膜/滤纸夹层放入电泳装置中，注意凝胶面应朝向负极。 50 mA电转移2 h。 转移完毕后，将PVDF膜在含1% Tween－20的PBS (PBST)中漂洗1 min。 将膜置于封闭液（5%的脱脂奶粉或3% BSA）中，室温下缓慢振荡2 h。 弃封闭液，用洗涤液洗膜3次，室温缓慢振荡摇动，每次5－10 min。 将膜浸入在兔抗纳豆激酶多克隆抗体溶液中（用含1% BSA的PBS进行1：500稀释），室温下，缓慢摇动2 h。 膜用洗涤液洗3次，每次缓慢摇动5－10 min。 把膜转移到HRP标记的二抗中（用含1% BSA的PBS进行1：1000稀释），室温下缓慢摇动1 h。 用洗涤液洗膜3次，每次5－10 min。 用PBS洗膜3次，去除膜表面多余的Tween－20。 将膜浸入显色液DAB中，避光显色直至条带清晰。 用蒸馏水终止反应。 1.2.4 免疫沉淀法纯化蚕血淋巴中表达产物 1.2.4.1 制备抗体结合胶 将Seize primary immunoprecipitation kit 平衡到室温。 将胶混匀，加400μL 50% 的胶混合液到Spin Cup Column中，将柱放到离心管中，将柱放入离心管中， 5000g离心1分钟。 弃滤液，加0.4 ml Coupling buffer,颠倒混匀，重新悬浮凝胶，5000g离心1分钟。 弃滤液，重复步骤3。 将柱放入一个新的离心管中，加入Coupling buffer稀释的抗体400μL（200μg抗体）。 加入4μL 5M sodium cyanoborohydride ,颠倒混匀。 室温下轻晃孵育4 h至过夜。 离心，弃滤液。将柱子放入一个新的离心管中，加0.4 ml Coupling buffer，颠倒混匀十次，离心, 弃滤液。 加入0.4 ml Quenching buffer，颠倒混匀十次，离心，弃滤液。 加入0.4 ml Quenching buffer，加入4μL 5M sodium cyanoborohydride ,颠倒混匀。 室温轻晃孵育30 min，离心，弃滤液。 用0.4 ml Washing buffer 洗六次。 用0.4 ml Binding buffer 洗六次。 1.2.4.2 抗原免疫反应 用Binding buffer稀释抗原样品，用0.22μm过滤，样品总体积为0.4 m